喬君 高翔 王瑜 梅仁彪

摘 要：目的 探討血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑纈沙坦對(duì)高血壓患者外周血單核細(xì)胞中IL-17表達(dá)的影響。方法 選取2016年9月～2017年10月在我院收治的原發(fā)性高血壓患者98例，將所有患者按照隨機(jī)數(shù)字表法分為纈沙坦組和硝苯地平組，各49例，纈沙坦組患者使用纈沙坦治療，硝苯地平組患者使用硝苯地平緩釋片治療，另選取健康體檢者20例為正常組。采集患者治療前及治療4周后靜脈血，分離PBMC體外培養(yǎng)5 h后用RT-PCR法測定IL-17 mRNA表達(dá)水平；培養(yǎng)上清液采用ELISA法測定IL-17濃度。結(jié)果 治療4周后纈沙坦組與硝苯地平組血壓變化比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；纈沙坦組治療后PBMC中IL-17 mRNA表達(dá)及培養(yǎng)上清液中IL-17濃度分別為（0.29±0.09），（76.16±20.56）pg/ml，低于硝苯地平組的（0.50±0.15），（137.84±39.97）pg/ml，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 纈沙坦可顯著降低高血壓患者PBMC中IL-17的表達(dá)，有助于延緩疾病發(fā)展。

關(guān)鍵詞：纈沙坦；高血壓；IL-17

中圖分類號(hào)：R544.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.021

文章編號(hào)：1006-1959（2018）07-0065-04

The Effect of Valsartan on the Expression of IL-17 in Peripheral PBMC of Patients with Essential Hypertension

QIAO Jun1，2，GAO Xiang3，WANG Yu1，MEI Ren-biao1

（1.Department of Medical Science and Research，Anhui University Of Science and Technology Medical College，Huainan 232001，Anhui，China；

2.Department of Laboratory，Huainan Second People's Hospital，Huainan 232072，Anhui，China；

3.Department of Internal Medicine，Huainan Second People's Hospital，Huainan 232072，Anhui，China）

Abstract：Objective To investigate the effect of valsartan， an angiotensinⅡreceptor blocker，on the expression of IL-17 in peripheral blood monocytes of patients with hypertension.Methods 98 patients with essential hypertension admitted in our hospital from September 2016 to October 2017 were randomly divided into valsartan group and nifedipine group（49 cases each）.Patients in valsartan group were treated with valsartan，nifedipine group was treated with nifedipine sustained release tablet，and 20 healthy cases were selected as normal group.Venous blood was collected before and after 4 weeks of treatment.The expression of IL-17 mRNA was measured by RT-PCR method after 5 h culture of PBMC in vitro，and the IL-17 concentration was measured by ELISA method in the supernatant of culture supernatant.Results After 4 weeks of treatment， there was no significant difference in blood pressure between valsartan group and nifedipine group，the difference was not statistically significant（P>0.05），the IL-17 mRNA expression in PBMC and the concentration of IL-17 in the culture supernatant of the valsartan group were（0.29±0.09），（76.16±20.56）pg/ml，respectively，lower than that of the nifedipine group（0.50±0.15），（137.84±39.97）pg/ml，the difference between the groups was statistically significant（P<0.05）.Conclusion Valsartan can significantly reduce the expression of IL-17 in the PBMCs of hypertensive patients and help to delay the development of the disease.

Key words：Valsartan；Hypertension；IL-17

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是指以體循環(huán)動(dòng)脈壓增高為特征的臨床綜合征。長期高血壓可影響心、腦、腎等重要器官的功能，最終導(dǎo)致這些器官功能衰竭，引發(fā)心絞痛、心肌梗死、心力衰竭、心源性猝死、腦卒中、腎小球硬化及腎實(shí)質(zhì)纖維化等多種并發(fā)癥。目前研究證實(shí)高血壓與免疫紊亂具有相關(guān)性，白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）是一種促炎細(xì)胞因子，在高血壓時(shí)通過多重作用，對(duì)高血壓的維持和發(fā)展起重要作用。血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑（angiotensin Ⅱ receptor blocker，ARB）可與血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensin II type 1 receptor，AT1R）結(jié)合從而拮抗血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）的升壓作用。鈣通道阻滯劑（calcium-channel blocker，CCB）主要通過阻斷心肌和血管平滑肌細(xì)胞膜上的鈣離子通道，抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平降低而引起心血管等組織器官功能改變。ARB和CCB都是治療高血壓的常用藥物。目前研究發(fā)現(xiàn)ARB在發(fā)揮降壓作用的同時(shí)，對(duì)機(jī)體的免疫系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生影響。本研究旨在探究ARB與高血壓患者外周PBMC中IL-17蛋白及其mRNA表達(dá)是否存在關(guān)聯(lián)以及如何影響IL-17蛋白及其mRNA的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料 PBMC分離液（Solarbio），PMA（Mkbio），Ionomycin（Mkbio），RPMI-1640（Hyclone），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo scientific），Taq PCR Master Mix（上海生工），PCR引物（上海生工），IL-17A ELISA試劑盒（eBioscience），梯度PCR儀（Biometra Tgradient）， Multiskan Mk3型酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific），VIW-2三恒電泳儀（浙江建德電表儀器廠），凝膠成像儀（Bio-Rad）。

1.2一般資料 2016年9月～2017年10月在淮南市第二人民醫(yī)院門診體檢正常者20例為正常組，門診或住院治療的原發(fā)性高血壓患者98例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《國家基層高血壓防治管理指南2017》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡>18歲且<80歲；③所有受試對(duì)象均知曉本次研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①各種繼發(fā)性高血壓患者；②自身免疫性疾病患者；③嚴(yán)重感染性疾病及血液病患者。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將98例原發(fā)性高血壓患者分為纈沙坦組和硝苯地平組，每組49例。纈沙坦組中，男26例，女23例，年齡36～77歲，平均年齡（65.32±7.65）歲；1級(jí)高血壓19例，2級(jí)高血壓25例，3級(jí)高血壓5例。硝苯地平組中男，25例，女24例，年齡37～76歲，平均年齡（65.98±7.15）歲；1級(jí)高血壓20例，2級(jí)高血壓23例，3級(jí)高血壓6例。正常組中，男11例，女9例，年齡39～75歲，平均年齡（62.32±6.62）歲。三組性別、年齡、高血壓分級(jí)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），研究可進(jìn)行。

1.3方法 患者入組前均未接受過降壓藥物治療或停用2周以上降壓藥物。纈沙坦組給予纈沙坦分散片（80 mg，皇隆制藥，H20050508）80 mg，1次/d，清晨口服；硝苯地平組給予硝苯地平緩釋片（Ⅰ）（10 mg，步長高新制藥，H61023583）10 mg，2 次/d；兩組患者療程均為4周。

1.3.1血壓的測量 清晨空腹安靜狀態(tài)下用水銀柱血壓計(jì)測量3次血壓，每次間隔1 min。3次讀數(shù)取平均值作為最終測量結(jié)果。

1.3.2 PBMC中IL-17 mRNA的檢測 治療前后清晨空腹用肝素真空采血管采集肘靜脈血3 ml，使用PBMC分離液分離PBMC，用RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/ml。取細(xì)胞懸液300 μl加入12 μg/ml PMA工作液7.5 μl和50 μg/ml Ionomycin工作液6 μl，混勻，于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)5 h。加入Trizol 1 ml，按照氯仿-異丙醇法提取總RNA，隨后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)IL-17 mRNA引物，以GAPDH mRNA為內(nèi)參。引物序列如下：GAPDH上游引物5'-GCCACATCGCTCAGACA-3'，下游引物5'- CCTGCTTCACCACCTTCT-3'，產(chǎn)物長度812bp；IL-17上游引物5'-CAACCTGAACATCCATAACC-3'，下游引物5'-GTCGGCTCTCCATAGTCT-3'，產(chǎn)物長度380bp。PCR反應(yīng)體系組成：Taq PCR Master mix 12.5 μl，cDNA模版2 μl，上游引物（10 μmol/L）1 μl，下游引物（10 μmol/L）1μl，RNase-Free ddH2O 8.5 μl， 混勻并短暫離心。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：預(yù)變性95 ℃ 5min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，終末延伸72 ℃ 10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min（100 V），使用凝膠成像儀拍照并測量IL-17 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3培養(yǎng)上清液中IL-17濃度的檢測 上述培養(yǎng)液在加入Trizol前，先離心后收集部分上清液置-85 ℃冰箱冷凍保存。按照ELISA試劑盒使用說明書操作，使用酶標(biāo)儀測量OD值并計(jì)算IL-17血漿濃度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均以（x±s）表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析（oneway，ANOVA），若方差齊者則采用LSD法比較兩組間差異，數(shù)據(jù)間相關(guān)性采用Pearson檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1兩組治療前后血壓的比較 兩組治療前收縮壓與舒張壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），治療后兩組收縮壓與舒張壓均顯著下降，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2兩組治療前后IL-17 mRNA表達(dá)及IL-17濃度變化的比較 兩組治療前IL-17 mRNA表達(dá)及IL-17濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后，纈沙坦組IL-17 mRNA表達(dá)及IL-17濃度顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），硝苯地平組IL-17 mRNA表達(dá)及IL-17濃度下降不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3纈沙坦組IL-17 mRNA及IL-17表達(dá)水平與血壓水平的相關(guān)性分析 纈沙坦組高血壓患者經(jīng)治療后PBMC中IL-17 mRNA相對(duì)表達(dá)量的下降值與收縮壓的下降值進(jìn)行線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.854，雙側(cè)Pearson檢驗(yàn)P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。PBMC培養(yǎng)上清液中IL-17濃度下降值與收縮壓下降值進(jìn)行線性相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)系數(shù)r=0.798，雙側(cè)pearson檢驗(yàn)P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

3 討論

目前研究證實(shí)高血壓的發(fā)生、發(fā)展中存在著低程度的炎癥反應(yīng)與免疫紊亂。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）中的循環(huán)激素在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，此外還可能作為組織RAS的成分發(fā)揮局部作用。生理水平的AngⅡ與屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的AT1R結(jié)合，后者激活并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，最終發(fā)揮調(diào)節(jié)血壓和體液平衡的作用。AT1R的過度刺激可引起高血壓等疾病，在這一過程中血壓輕度升高可能引起輕微的組織損傷以及損傷相關(guān)分子模式和新抗原的形成，導(dǎo)致抗原提呈細(xì)胞活化、初始CD4+T細(xì)胞極化為炎性細(xì)胞，分泌多種炎性因子，結(jié)果使得組織器官損傷加重、血壓進(jìn)一步升高。

ARB是治療高血壓的常用藥物之一，降壓作用明確且降壓效果與其他抗高血壓藥物相似，可單獨(dú)或與其他抗高血壓藥聯(lián)合使用。ARB是非肽類小分子量化合物，可與AngⅡ競爭性結(jié)合AT1R，從而阻斷AngⅡ的升壓作用，此外，ARB在減輕左心室肥厚、小動(dòng)脈重塑[1]、大動(dòng)脈硬化[2]方面的作用優(yōu)于其他抗高血壓藥物。目前研究發(fā)現(xiàn)ARB可通過影響動(dòng)脈重塑及減少動(dòng)脈壁纖維化而緩解血管硬化[3]，但具體機(jī)制仍不清楚。近期發(fā)現(xiàn)屬于ARB的纈沙坦可調(diào)節(jié)心臟水通道蛋白1和血管生成因子的表達(dá)而發(fā)揮心血管的保護(hù)作用[4]。

在涉及高血壓的炎性細(xì)胞中，Th17細(xì)胞發(fā)揮著重要作用。Th17細(xì)胞是一群獨(dú)特的CD4+細(xì)胞，因分泌IL-17而得名。IL-17具有強(qiáng)大的促炎作用，可促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生，并有促進(jìn)纖維化作用[5]，此外還可調(diào)節(jié)腎鈉轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)血管、腎臟的損傷及高血壓的維持[6]。那么ARB的治療作用與IL-17是否存在某種關(guān)聯(lián)呢？這就是我們此項(xiàng)研究的切入點(diǎn)。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，經(jīng)纈沙坦治療之后患者血壓顯著下降，說明纈沙坦具有確切的抗高血壓作用。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)纈沙坦治療之后患者外周PBMC中IL-17 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，培養(yǎng)上清液中IL-17濃度顯著下降，且下降值與血壓下降值存在顯著的正相關(guān)性。鑒于IL-17強(qiáng)大的促炎作用，其mRNA及蛋白表達(dá)的下調(diào)對(duì)于組織器官損傷的修復(fù)無疑是有益的，那么，纈沙坦對(duì)于改善血管內(nèi)皮功能和減少血管及腎臟等器官纖維化的作用是不是通過或部分通過IL-17信號(hào)來實(shí)現(xiàn)的呢？這還有待于進(jìn)一步研究?？傊i沙坦可以有效地降低血壓并可降低外周PBMC中IL-17 mRNA表達(dá)以及IL-17濃度，有助于減輕或延緩高血壓并發(fā)癥的發(fā)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]Agabiti-Rosei E，Heagerty AM，Rizzoni D.Effects of antihypertensive treatment on small artery remodelling[J].J Hypertens，2009，27（6）：1107-1114.

[2]Boutouyrie P，Lacolley P，Briet M，et al.Pharmacological modulation of arterial stiffness[J].Drugs，2011，71（13）：1689-1701.

[3]Laurent S，Boutouyrie P.Dose-dependent arterial destiffening and inward remodeling after olmesartan in hypertensives with metabolic syndrome[J].Hypertension，2014，64（4）：709-716.

[4]Jiang Y，Wang HY，Zheng S，et al.Cardioprotective effect of valsartan in mice with short-term high-salt diet by regulating cardiac aquaporin 1 and angiogenic factor expression[J].Cardiovasc Pathol，2015，24（4）：224-229.

[5]Saleh MA，Norlander AE，Madhur MS.Inhibition of Interleukin 17-A but not Intereukin-17F Signaling Lowers Blood Pressure and Reduces End-organ Inflammation in Angiotensin Ⅱ-induced Hypertension[J].JACC Basic Transl Sci，2016，1（7）：606-616.

[6]Norlander AE，Saleh MA，Kamat NV，et al.Interleukin-17A regulates renal sodium transporters and renal injury in Angiotensin Ⅱ-induced hypertension[J].Hypertension，2016，68（1）：167-174.

收稿日期：2018-2-24；修回日期：2018-3-2

編輯/成森