周業(yè) 張和良 劉重元 羅招陽(yáng) 張志偉

摘 要：目的 探討LMP1羧基端功能活性區(qū)促進(jìn)鼻咽癌干細(xì)胞SP18增殖作用機(jī)制。方法 采用生長(zhǎng)曲線、平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)與軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)分析LMP1TRADD對(duì)SP18細(xì)胞增殖的作用；運(yùn)用Western-blot檢測(cè)SP18細(xì)胞中Wnt1、β-catenin與p-β-catenin蛋白的表達(dá)。結(jié)果 SP18-LMP1TRADD細(xì)胞的增殖能力較SP18-LMP1細(xì)胞減弱（P<0.01）；與SP18-LMP1細(xì)胞比較，SP18-LMP1TRADD細(xì)胞中Wnt1與β-catenin表達(dá)降低，而p-β-catenin蛋白表達(dá)增加（P<0.01）。結(jié)論 LMP1經(jīng)Wnt1/β-catenin途徑促進(jìn)鼻咽癌干細(xì)胞SP18的增殖。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌干細(xì)胞；LMP1；Wnt1/β-catenin通路；細(xì)胞增殖

中圖分類(lèi)號(hào)：R318.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.07.024

文章編號(hào)：1006-1959（2018）07-0075-03

LMP1 through Wnt1/β-catenin Pathway to Promote the Proliferation of SP18 in Nasopharyngeal Carcinoma Stem Cells

ZHOU Ye，ZHANG He-liang，LIU Zhong-yuan，LUO Zhao-yang，ZHANG Zhi-wei

（ Key Laboratory of Tumor Cell and Molecular Pathology，Institute of Oncology，School of Medicine，South China University，Hengyang， 421001，Hunan，China）

Abstract：Objective To investigate the mechanism of the carboxyl-terminal functional active region of LMP1 in promoting proliferation of nasopharyngeal carcinoma SP18 stem cells.Methods Growth curve，plate colony formation assay and soft agar colony assay were used to analyze the effect of LMP1TRADD on the proliferation of SP18 cells.The expression of Wnt1，β -catenin and p-β-catenin in SP18 cells was detected by Western-blot.Results The proliferative ability of SP18-LMP1TRADD cells was lower than that of SP18-LMP1 cells（P<0.01），compared with SP18-LMP1 cells， the expression of Wnt1 and β-catenin in SP18-LMP1TRADD cells decreased，while the expression of p-β-catenin protein increased（P<0.01）.Conclusion LMP1 can promote the proliferation of SP18 in nasopharyngeal carcinoma stem cells via Wnt1/β-catenin pathway.

Key words：Nasopharyngeal carcinoma stem cells；LMP1；Wnt1/β-catenin pathway；Cell proliferation

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國(guó)廣東、廣西、湖南和香港等南方地區(qū)最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤。大量研究證實(shí)，EB病毒感染與NPC發(fā)病密切相關(guān)[1]。鼻咽癌干細(xì)胞在鼻咽癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、放療抵抗與耐藥的發(fā)揮重要作用。潛伏性膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是EB病毒編碼的重要致瘤蛋白之一[2-4]。LMP1羧基末端包括三個(gè)功能活化區(qū)（carboxy terminal activating region，CTAR），即CTAR1、CTAR2和CTAR3[5-7]，其中CTAR2區(qū)域包含有腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡區(qū)（TRADD），是活性區(qū)重要的轉(zhuǎn)化位點(diǎn)[7-9]。然而，LMP1表達(dá)對(duì)鼻咽癌干細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響及分子機(jī)制仍不十分清楚。

1材料與方法

1.1細(xì)胞與質(zhì)粒 鼻咽癌干細(xì)胞SP18由中山大學(xué)腫瘤研究所建立并惠贈(zèng)，細(xì)胞培養(yǎng)采用低血清（2%～5%）血清（購(gòu)自杭州四季青公司）的RPMI1640（Gibco BRL公司）培養(yǎng)。逆病毒質(zhì)粒pLNSX-LMP1和pLNSX-LMP1TRADD（LMP1的CTAR2區(qū)域TRADD突變）[5-7]由中南大學(xué)腫瘤研究所構(gòu)建并惠贈(zèng)。

1.2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 取2×103個(gè)SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細(xì)胞接種于24孔板種中，每組均接種3個(gè)平行孔細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，每天2組取3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)，重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取均值為每組細(xì)胞數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)細(xì)胞6 d，將所得不同時(shí)間計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)連接后，繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 分別取300個(gè)SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細(xì)胞接種于24孔板中，每組均接種3個(gè)平行孔，將24孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周后，觀察細(xì)胞克隆形成情況，每孔加入1 ml甲醇進(jìn)行細(xì)胞固定1 h后，加入0.5 ml的0.4%結(jié)晶紫染色15 min，肉眼計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取3孔均值為每組克隆數(shù)，然后計(jì)算細(xì)胞克隆形成率，為形成克隆數(shù)比接種細(xì)胞數(shù)即為克隆形成率。

1.4軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn) 用瓊脂糖制備0.6%底層瓊脂，冷卻后用瓊脂糖及細(xì)胞制備0.3%頂層瓊脂（每孔含2×103個(gè)細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)設(shè)SP18-LMP1和SP18-LMP1TRADD細(xì)胞組，每組3個(gè)平行孔，然后將24孔板置于37℃ 5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)2周后。觀察集落形成情況并計(jì)數(shù)，其中細(xì)胞數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)集落，每孔重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取3孔均值為每組集落數(shù)。計(jì)算細(xì)胞集落形成率為集落數(shù)比接種細(xì)胞數(shù)即為集落形成率。

1.5 Western-blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以30 μg總蛋白/泳道，進(jìn)行10% SDS不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗（1∶1000）室溫孵育濾膜1 h，洗膜，HRP標(biāo)記二抗（1∶1000）室溫孵育濾膜1 h，洗膜后曝光、顯影、定影，分析結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（x±s）表示，兩組間均數(shù)比統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 LMP對(duì)SP18細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將LMP1及LMP1TRADD導(dǎo)入SP18后，結(jié)果顯示，SP18-LMP1細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯快于SP18-LMP1TRADD細(xì)胞的生長(zhǎng)，說(shuō)明LMP1可以促進(jìn)SP18細(xì)胞的生長(zhǎng)，而其CTAR2區(qū)域TRADD在促進(jìn)SP18細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用（P<0.05），見(jiàn)圖1。

注：#SP18-LMP1 vs. SP18-LMP1TRADD，P<0.05

圖1 SP18-LMP1與SP18-LMP1TRADD細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.2 LMP對(duì)SP18細(xì)胞增殖的影響 將LMP1及LMP1TRADD導(dǎo)入SP18后，結(jié)果顯示，SP18-LMP1形成的細(xì)胞克隆與集落數(shù)量及體積均大于SP18-LMP1TRADD細(xì)胞，同樣說(shuō)明LMP1可以促進(jìn)SP18細(xì)胞的增殖，而其CTAR2區(qū)域TRADD在促進(jìn)SP18細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用（n=3，P<0.05），見(jiàn)表1。

2.3 Western-blot檢測(cè)NF-кB P65蛋白的表達(dá) 為了解LMP1的CTAR2區(qū)域TRADD促進(jìn)SP18細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，采用Western-blot檢測(cè)LMP1對(duì)SP18細(xì)胞Wnt1通路的影響。結(jié)果顯示，SP18-LMP1細(xì)胞中Wnt1與β-catenin蛋白的表達(dá)較SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表達(dá)低，說(shuō)明LMP1活化Wnt1/β-catenin通路，而CTAR2區(qū)域TRADD是通路活化的重要部位。

注：1：SP18-LMP1細(xì)胞；2：SP18-LMP1TRADD細(xì)胞

圖2 Western-blot檢測(cè)Wnt1、β-catenin與

p-β-catenin蛋白的表達(dá)

3討論

自Hamburger等[10]提出腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cell，TSC）以來(lái)，不同組織來(lái)源的TSC不斷被分離，如乳腺癌[11]、肝癌[12]和肺癌[13]等。腫瘤組織TSC細(xì)胞數(shù)量少，其具有干細(xì)胞特性，被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生和復(fù)發(fā)的根源。目前，鼻咽癌干細(xì)胞的生物學(xué)行為仍不清楚，其在NPC的作用及對(duì)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥等的影響仍有待深入研究。EB病毒感染與NPC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在人體常潛伏感染，編碼多種潛伏蛋白[2-4]。其中LMP1是EB病毒基因組編碼促細(xì)胞癌變和轉(zhuǎn)移作用的重要致瘤蛋白[5-7]。

LMP1蛋白作為EB病毒編碼的重要致瘤蛋白，其在細(xì)胞功能的完成依賴(lài)于羧基端胞漿區(qū)的3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，其中CTAR2（351～386aa）位于羧基端胞漿區(qū)末端，是羧基端重要的功能活性區(qū)域，能與TRADD蛋白結(jié)合，參與介導(dǎo)高水平NF- B及AP-1的活化[6-9]。本研究結(jié)果顯示，將LMP1導(dǎo)入SP18細(xì)胞后，CTAR2的TRADD活性區(qū)LMP1突變體促SP18生長(zhǎng)及增殖能力均明顯低于野生型LMP1，說(shuō)明LMP1-CTAR2的TRADD活性區(qū)參與了其促SP18細(xì)胞增殖的作用。

腫瘤干細(xì)胞中存在多條重要的信號(hào)途徑，其中Wnt/β-catenin途徑就是其中之一。細(xì)胞內(nèi)Wnt途徑包括兩條，其一是決定細(xì)胞命運(yùn)的經(jīng)典通路，其二是控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)與組織極性的非經(jīng)典通路[14]。Wnt經(jīng)典途徑參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin穩(wěn)定、其進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，入核參與基因表達(dá)的調(diào)控。β-catenin游離于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)并異常積聚，促進(jìn)其入核。β-catenin量的蓄積、入核是Wnt/β-catenin信號(hào)途徑活化的關(guān)鍵[15]。Wnt1/β-catenin通路的活化在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有十分明顯的作用[16]。

本研究結(jié)果顯示，SP18-LMP1細(xì)胞中Wnt1與β-catenin蛋白的表達(dá)較SP18-LMP1TRADD高，而p-β-catenin蛋白表達(dá)低，說(shuō)明LMP1促進(jìn)SP18細(xì)胞中Wnt1與β-catenin蛋白表達(dá)，且使β-catenin磷酸化抑制，導(dǎo)致細(xì)胞漿中游離β-catenin含量增加且入核量也上升，從而激活Wnt-1/β-catenin途徑，從而發(fā)揮其促進(jìn)SP18細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果說(shuō)明LMP1的CTAR2可能通過(guò)TRADD位點(diǎn)活化Wnt-1/β-catenin途徑促進(jìn)SP18細(xì)胞增殖，但如何發(fā)揮調(diào)節(jié)功能有待后續(xù)深入研究。

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收稿日期：2017-11-22；修回日期：2017-11-23

編輯/楊倩