曹龍奎，康麗君，寇 芳，沈 蒙，葛云飛，王維浩

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

糖尿病作為一類慢性疾病已嚴(yán)重危害人們健康和生活質(zhì)量，患者通常以注射胰島素并長期使用降血糖藥物維持正常血糖水平[1]。α-葡萄糖苷酶抑制劑是目前應(yīng)用較廣泛的降血糖藥物[2]。α-葡萄糖苷酶抑制劑參與競爭性抑制小腸黏膜刷狀緣上的α-葡萄糖苷酶，減緩碳水化合物快速分解成葡萄糖，從而達到調(diào)節(jié)糖尿病患者餐后血糖的作用[3-4]。開發(fā)自然來源的α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為糖尿病治療的熱點。研究表明，一些天然產(chǎn)物如多糖類[5]、多酚類[6]、黃酮類[7]等在抑制α-葡萄糖苷酶活性方面表現(xiàn)突出。膳食纖維的一些生理作用已得到科學(xué)實驗證實，如促進胃腸道健康、預(yù)防肥胖、降低心血管疾病和糖尿病的病發(fā)率等[8]。為了防護慢性疾病的發(fā)生，應(yīng)適當(dāng)增加膳食纖維的攝入。

小米糠為谷子加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其中含有50%～60%的膳食纖維。美國谷物化學(xué)家協(xié)會將膳食纖維定義為“膳食纖維是一種在人體小腸耐消化、吸收，在大腸完全或部分發(fā)酵的植物可食部分或類似碳水化合物”[9]。根據(jù)其溶解性不同可分為不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）和水溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）[10]。SDF在調(diào)節(jié)血糖、血脂，防止心血管疾病等方面具有良好的生理活性[11-14]。如何采用簡便有效的改性方法使IDF向SDF轉(zhuǎn)化，成為膳食纖維改性研究的熱點[15-16]。利用先進的技術(shù)手段分析改性方法對膳食纖維結(jié)構(gòu)的影響，已成為膳食纖維研究領(lǐng)域的重點。

本實驗以小米糠為實驗材料，采用超聲-微波協(xié)同法對氣爆預(yù)處理小米糠膳食纖維進行改性處理，同時借助掃描電子顯微鏡、凝膠色譜-示差-多角度激光光散射[17]和離子色譜法[18]等技術(shù)對改性前后小米糠膳食纖維的結(jié)構(gòu)進行分析。目前有關(guān)小米糠SDF的研究多集中在提取工藝、改性方法和理化特性方面[19-20]，關(guān)于小米糠SDF能否通過抑制α-葡萄糖苷酶活性這一重要途徑來調(diào)節(jié)血糖的研究鮮見報道。通過建立α-葡萄糖苷酶抑制劑體外模型，研究改性前后小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，為膳食纖維功能性產(chǎn)品的開發(fā)和動物實驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅谷小米糠 黑龍江省大慶肇州托古小米廠；耐高溫α-淀粉酶、中性蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、對硝基苯酚吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenol glucopyranoside，PNPG） 美國Sigma公司；牛血清白蛋白 上海Aladdin公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GDE-CSF6膳食纖維測定儀 意大利VELP公司；QBS-200B型氣爆工藝試驗臺 鶴壁正道生物能源公司；K-360全自動凱氏定氮儀 瑞士BüCHI公司；S-570掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DAWNHELEOSⅡ多角度激光光散射、OPTILAB T-rEX示差檢測器美國Wyatt公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀、ICS5000離子色譜儀 美國Thermo Fisher公司；MR-96A酶標(biāo)儀 深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米糠的預(yù)處理

脫脂小米糠：取適量小米糠粉碎，40 ℃烘干，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在6%～8%范圍內(nèi)，過40 目篩，進行脫脂處理[21]，備用。

氣爆小米糠：稱取500 g小米糠加入氣爆反應(yīng)器中進行處理。設(shè)置不同的氣爆壓力和時間，小米糠經(jīng)氣爆預(yù)處理后烘干、粉碎、過篩、脫脂。1.3.2 小米糠SDF、IDF的制備

改性前小米糠膳食纖維：稱取5.0 g脫脂小米糠，分別經(jīng)耐高溫α-淀粉酶、中性蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶的酶解，滅酶，濾液濃縮后，用4 倍體積的95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液醇沉、離心、干燥得SDF，濾渣用熱水洗滌、干燥得IDF。同時去除空白、未消化蛋白質(zhì)、灰分的影響。

改性后小米糠膳食纖維：稱取5.0 g氣爆小米糠，分別經(jīng)耐高溫α-淀粉酶、中性蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶的酶解，滅酶，將全部反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至超聲-微波協(xié)同萃取儀中進行改性處理，設(shè)置微波功率535 W、料液比1∶50（m/V）、超聲-微波協(xié)同處理時間53 min，濾液濃縮后，用4 倍體積的95%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液醇沉、離心、干燥得SDF，濾渣用熱水洗滌、干燥得IDF。

1.3.3 小米糠SDF的超微結(jié)構(gòu)觀察

取適量樣品固定于觀察臺上，采用離子濺射方法鍍金，置于掃描電子顯微鏡下觀察、分析[22]。

1.3.4 小米糠SDF相對分子質(zhì)量分布測定

樣品處理方法：取10 mg SDF樣品，加1.0 mL 0.1 mol/L NaNO3溶液，45 ℃孵育4 h，再稀釋4 倍，過0.22 μm濾膜，取100 μL上樣[23]。

檢測條件：流動相為0.1 mol/L NaNO3，流速為0.8 mL/min，柱溫為45 ℃，分析柱型號為Ohpak SB-804 HQ、Ohpak SB-803 HQ，上樣量100 μL。

1.3.5 小米糠IDF的X射線衍射測試

將小米糠IDF進行干燥、粉碎，研磨至無顆粒感，隨后將樣品均勻灑入框內(nèi)，略高于框板面，并用不銹鋼片壓實樣品，確保樣品緊密平整且表面光滑，與框緊密結(jié)合，將樣品框插在測角儀中心的底座上，進行測試[24]。

1.3.6 小米糠SDF、IDF的傅里葉變換紅外光譜測定

稱取小米糠SDF和IDF，在紅外燈下將樣品與KBr粉末混勻并充分研磨，利用真空壓片機進行壓片，置于傅里葉變換紅外光譜儀中掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，繪制傅里葉變換紅外光譜圖[25]。

1.3.7 小米糠SDF的單糖組成成分分析

1.3.7.1 小米糠SDF的水解

分別稱取5 mg小米糠SDF，各加入2.5 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），在121 ℃烘箱內(nèi)水解2 h，冷卻至室溫用氮氣吹干，加少量甲醇并用氮氣反復(fù)吹干，加入1 mL水溶解，定容至100 mL，最后取25 μL上樣[26]。

1.3.7.2 離子色譜分析

Dionex ICS 5000離子色譜儀，檢測器：PAD（脈沖安培檢測器）；分析柱型號：CarboPac-PA10，柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL/ min；流動相條件：0～40 min：5 mmol/L NaOH，40～45 min：100 mmol/L NaOH+100 mmol/L NaOAc，45～50 min：200 mmol/L NaOH，50.2～55.0 min：5 mmol/L NaOH。

1.3.7.3 單糖含量的計算

單糖含量的計算按照式（1）進行。

1.3.8 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的測定

1.3.8.1 樣品處理方法

稱取100 mg脫脂小米糠SDF，溶于蒸餾水中，過0.45 μm濾膜，配制成20 mg/mL的樣品溶液。依次取0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL樣品溶液，并依次添加蒸餾水至2 mL，配制成不同質(zhì)量濃度梯度的待測樣品溶液。

改性小米糠SDF樣品溶液增加一個質(zhì)量濃度梯度（1.2 mL樣品溶液添加蒸餾水至2 mL），其他處理同脫脂小米糠SDF樣品溶液。

1.3.8.2 測定方法

采用96 孔酶標(biāo)儀測定α-葡萄糖苷酶抑制活力[27-28]。在96 孔酶標(biāo)板中先后加入100 μL濃度為0.5 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液、20 μL質(zhì)量濃度為0.913 3 mg/mL的底物PNPG溶液、20 μL酶溶液、15 μL不同質(zhì)量濃度梯度的待測樣品溶液。然后水平振蕩酶標(biāo)板使溶液混勻，密封，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h。反應(yīng)完成后，取出酶標(biāo)板，依次加入50 μL濃度為0.57 mo1/L Na2CO3溶液來終止反應(yīng)。該反應(yīng)過程中會釋放一定量的對硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP），該物質(zhì)在405 nm波長處有最大吸收峰，在一定濃度范圍內(nèi)，此物質(zhì)的吸光度與α-葡萄糖苷酶抑制率正相關(guān)。空白對照組中由與樣品體積相等的蒸餾水代替。α-葡萄糖苷酶抑制率（AGA）的計算公式如式（2）所示。

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為空白組的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性前后小米糠SDF含量比較

結(jié)果表明，經(jīng)超聲-微波協(xié)同改性后的小米糠SDF含量（10.841%）明顯增加，遠高于未經(jīng)改性的小米糠SDF含量（2.157%），說明超聲-微波協(xié)同改性適用小米糠膳食纖維改性工藝的研究。

2.2 改性前后小米糠SDF的超微結(jié)構(gòu)

圖1 改性前后小米糠SDF的掃描電子顯微鏡圖Fig. 1 SEM images of millet bran SDF before and after modification

從掃描電子顯微鏡圖（圖1）可看出，在相同放大倍數(shù)下，改性前后小米糠SDF具有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)。脫脂小米糠SDF顆粒較大且顆粒大小不一，形狀為不規(guī)則碎片，表面較光滑，結(jié)構(gòu)較致密。改性小米糠SDF的顆粒表面變得粗糙，疏松多孔，呈蜂窩狀，是由小顆粒聚集在一起的。改性前后小米糠SDF微觀結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致了性質(zhì)差異。由于氣爆預(yù)處理和超聲-微波協(xié)同改性作用，改性小米糠SDF分子質(zhì)量較小，聚合度較低，這可能是改性小米糠SDF比脫脂小米糠SDF具有更好的溶解性和較小黏度的內(nèi)在原因。

2.3 改性前后小米糠SDF的相對分子質(zhì)量分布

圖2 改性前、后小米糠SDF的相對分子質(zhì)量分析圖Fig. 2 Molecular mass analysis of millet bran SDF before and after modification

表1 改性前后小米糠SDF相對分子質(zhì)量Table 1 Molecular mass determination of millet bran SDF before and after modification

SDF的功能活性和理化性質(zhì)與其相對分子質(zhì)量大小有關(guān)。圖2a、b分別為改性前后小米糠SDF的相對分子質(zhì)量分析圖，表1為改性前后小米糠SDF的相對分子質(zhì)量測定結(jié)果，結(jié)果表明：從重均相對分子質(zhì)量角度分析，改性小米糠SDF小于未經(jīng)改性小米糠SDF的相對分子質(zhì)量，說明改性小米糠SDF分子鏈變短和聚合度變低，與掃描電子顯微鏡結(jié)果一致。一般情況下，相對分子質(zhì)量越小，分子聚合度越低，物質(zhì)的溶解性越好，相同條件下黏度越小。重均相對分子質(zhì)量與數(shù)均相對分子質(zhì)量的比值為相對分子質(zhì)量分散系數(shù)，其大小可以作為判斷樣品相對分子質(zhì)量分布是否均一的指標(biāo)，分散系數(shù)越大，說明相對分子質(zhì)量越分散。總體來看，改性后小米糠SDF相對分子質(zhì)量的分散系數(shù)小于未經(jīng)改性小米糠SDF相對分子質(zhì)量的分散系數(shù)，說明改性后小米糠SDF分子鏈分布較均勻。此外低相對分子質(zhì)量的多糖類物質(zhì)一般都具有良好的生理活性，酶法制備條件比較溫和，活性物質(zhì)未受到破壞。

2.4 改性前后小米糠IDF的X射線衍射結(jié)果

圖3 改性前后小米糠IDF的X射線衍射譜圖Fig. 3 X-ray diffraction spectra of millet bran IDF before and after modification

如圖3所示，脫脂小米糠IDF在掃描角度2θ為21.97°處有明顯的結(jié)晶衍射峰，同時在16.38°、34.55°兩處有較弱的衍射峰；這些峰均表明脫脂小米糠IDF具有纖維素I型的X射線衍射曲線特征，說明小米糠膳食纖維的晶型與其他植物源膳食纖維相同。經(jīng)氣爆預(yù)處理和超聲-微波協(xié)同改性，改性小米糠IDF在掃描角度2θ為22.13°處有明顯的結(jié)晶衍射峰，同時在16.33°、34.51°兩處有較弱的衍射峰；說明改性小米糠IDF的晶體類型也是纖維素I型，為結(jié)晶區(qū)與非結(jié)晶區(qū)兩相共存的狀態(tài)。改性小米糠IDF與脫脂小米糠IDF比較，結(jié)晶峰的2θ值相近，表明這種改性方法并沒有使小米糠IDF的晶型發(fā)生改變。改性小米糠IDF衍射峰強度明顯增大，結(jié)晶度由原來的22.89%增大為25.55%；說明改性小米糠IDF表面結(jié)構(gòu)被破壞，致使纖維素結(jié)晶區(qū)暴露[29]。氣爆預(yù)處理和超聲-微波協(xié)同改性使小米糠IDF中半纖維素部分降解，并且轉(zhuǎn)化為SDF，也說明超聲-微波協(xié)同改性方法能夠有效提高小米糠SDF的含量。

2.5 改性前后小米糠SDF、IDF的傅里葉變換紅外光譜分析

圖4 改性前后小米糠SDF的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 4 Fourier transform infrared spectra of millet bran SDF before and after modification

如圖4所示，在3 300～3 500 cm-1內(nèi)出現(xiàn)較強的寬展圓滑的吸收峰是O—H的伸縮振動，脫脂小米糠SDF和超聲微波協(xié)同改性氣爆預(yù)處理小米糠SDF分別在3 415cm-1和3 411 cm-1處出現(xiàn)吸收峰。改性前后小米糠SDF分別在2 963 cm-1和2 960 cm-1處出現(xiàn)弱吸收峰，這是糖類甲基C—H的反對稱伸縮振動所致，1 200～1 400 cm-1范圍內(nèi)是C—H的變角振動吸收峰，這些區(qū)域的吸收峰為糖類的特征吸收峰。改性前后小米糠SDF分別在1 103 cm-1和1 079 cm-1處出現(xiàn)較強吸收峰，這是由C—O—C中C—O伸縮振動和C—O—H的O—H變角振動所致，也是多糖類的另一特征吸收峰。1 650cm-1附近為羧基—COOH的特征峰，峰強度較大，表明樣品中含有糖醛酸。改性前后小米糠SDF在1 405 cm-1處出現(xiàn)弱小尖峰，為C—H（—CH2）彎曲振動峰。兩者在804 cm-1處均出現(xiàn)吸收峰，而改性小米糠SDF在880 cm-1處出現(xiàn)弱小吸收峰，推測小米糠經(jīng)改性處理后，SDF的單糖組成與含量發(fā)生變化。改性小米糠SDF在3 442 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰更強，說明在制備改性小米糠SDF時，部分糖苷鍵斷裂，形成氫鍵增多。綜合分析得出改性前后小米糠SDF結(jié)構(gòu)很相似，由于含量或結(jié)合程度不同，導(dǎo)致它們在吸收強度上存在差異。

圖5 改性前后小米糠IDF的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of millet bran SDF before and after modification

如圖5所示，與脫脂小米糠IDF相比，超聲-微波協(xié)同改性氣爆預(yù)處理小米糠IDF的特征吸收峰的峰形、位置未發(fā)生明顯變化，說明小米糠膳食纖維的化學(xué)結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化。改性前后小米糠IDF都在3 430 cm-1左右出現(xiàn)寬展圓滑的吸收峰，這是由O—H的伸縮振動所致，在2 920 cm-1左右的吸收峰為糖類亞甲基C—H的反對稱伸縮振動，1 200～1 400 cm-1范圍內(nèi)吸收峰是C—H的變角振動所致，這些區(qū)域的吸收峰都為糖類的特征吸收峰。說明改性小米糠IDF的結(jié)構(gòu)并未完全破壞，氣爆預(yù)處理和超聲-微波協(xié)同改性使其部分降解。

2.6 改性前后小米糠SDF的單糖組成成分分析

圖6 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子色離譜圖Fig. 6 Ion chromatogram of monosaccharide standards

圖7 改性前后小米糠SDF中單糖的離子色譜圖Fig. 7 Ion chromatogram of monosaccharides in millet bran SDF before and after modification

由圖6、7可知，改性前后小米糠SDF中單糖種類變化不大，但改性前后小米糠SDF中各單糖的峰面積不同，說明兩者在單糖含量上存在差異。如表2所示，脫脂小米糠SDF和改性小米糠SDF都含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖，另外脫脂小米糠SDF含有少量的鼠李糖。經(jīng)改性處理后，改性小米糠SDF中的單糖總量略有增加，其中葡萄糖、甘露糖、果糖含量增加，阿拉伯糖、木糖含量減少，半乳糖含量幾乎不變。

表2 改性前后小米糠SDF中單糖的含量Table 2 Contents of monosaccharides in millet bran SDF before and after modification

2.7 改性前后小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶活性的影響

圖8 改性前后小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig. 8 Inhibitory effects of defatted millet bran and modified millet bran SDF on the activity of α-glucosidase

如圖8a所示，改性前后小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用，且隨著SDF質(zhì)量濃度的增大，SDF對α-葡萄糖苷酶的抑制率呈現(xiàn)上升趨勢，抑制作用與其質(zhì)量濃度之間存在顯著的量效關(guān)系。α-葡萄糖苷酶可以催化非還原α-（1→4）糖苷鍵，釋放出葡萄糖，同時能被小腸內(nèi)壁吸收[30]。以PNPG為反應(yīng)底物，經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解α-1,4-葡萄糖苷鍵后釋放出PNP，在pH＞7的條件下PNP呈現(xiàn)黃色，并在405 nm波長處釋放PNP。向該反應(yīng)中加入SDF，以此來抑制α-葡萄糖苷酶與底物PNPG的反應(yīng)，減少PNP的生成量[31]。另外，膳食纖維的生物活性與分子質(zhì)量大小和單糖組成也有關(guān)系。

如圖8b所示，在相同質(zhì)量濃度下，改性小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶的抑制率更大，說明改性小米糠SDF是一種抑制能力強于脫脂小米糠SDF的α-葡萄糖苷酶抑制劑。改性小米糠SDF表現(xiàn)出較強的α-葡萄糖苷酶抑制能力，推測原因為改性小米糠SDF中單糖組成比例發(fā)生改變，尤其是甘露糖含量的增加。研究顯示，由鼠李糖、甘露糖、半乳糖、半乳糖醛酸、果膠糖組成的多糖片段表現(xiàn)出很強的α-葡萄糖苷酶抑制能力[32]。另外可能與改性小米糠SDF的相對分子質(zhì)量較小有關(guān)，低相對分子質(zhì)量糖類不能形成聚合結(jié)構(gòu)從而表現(xiàn)出良好的生物活性。

以抑制率AGA為縱坐標(biāo)y，以SDF質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，得到脫脂小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶活性的抑制曲線方程為：y＝26.364 99×ln（x+15.627 73），R2＝0.902 82，半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為2.934 mg/mL；改性小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶活性的抑制曲線方程為：y＝29.777 59×ln（x+13.890 89），R2＝0.930 47，IC50為0.415 mg/mL。

3 結(jié) 論

對于脫脂小米糠SDF顆粒，改性小米糠SDF的顆粒較小且表面粗糙，疏松多孔，呈蜂窩狀。

從重均相對分子質(zhì)量角度分析，改性小米糠SDF小于脫脂小米糠SDF的相對分子質(zhì)量，說明改性小米糠SDF分子鏈變短和聚合度變低。

改性小米糠IDF的結(jié)晶度上升，小米糠IDF表面結(jié)構(gòu)破壞，使纖維素結(jié)晶區(qū)暴露。說明氣爆預(yù)處理和超聲-微波協(xié)同改性使小米糠IDF中半纖維素部分降解。

改性前后小米糠SDF均具有明顯的糖類特征吸收峰，其化學(xué)官能團基本不變。與脫脂小米糠IDF相比，改性小米糠IDF的特征吸收峰的峰形、位置無明顯變化，說明小米糠IDF的結(jié)構(gòu)并未完全破壞。

改性前后小米糠SDF均含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖，但兩者在含量上存在差異，說明氣爆預(yù)處理和超聲-微波協(xié)同改性改變了小米糠SDF中單糖組成比例。

脫脂小米糠SDF和改性小米糠SDF對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用。改性小米糠SDF是一種抑制作用強于脫脂小米糠SDF的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

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