馬浩然，賈海蓮，張文龍，王 晶，張男男，李可欣，邰大鵬，戈 娜,*

（1.包頭醫(yī)學院 營養(yǎng)與食品健康研究所，內蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院骨外科，內蒙古 包頭 014010；3.包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院消化科，內蒙古 包頭 014030）

酒精性肝損傷又稱酒精性肝病，是指長期大量飲酒所致的肝損傷，也是導致肝癌甚至急性肝衰竭最常見的誘因之一[1]。在臨床上常見酒精性肝病患者會伴有內毒素血癥的出現(xiàn)，而越來越多的研究也顯示，酒精能夠引起肝細胞損傷、腸道菌群改變、腸道上皮細胞屏障功能障礙、腸道細菌代謝產物易位和內毒素血癥的發(fā)生，揭示出腸道菌群在酒精誘導的肝損傷中扮演著重要的角色[2-4]。熊果酸（ursolic acid，UA）又名烏索酸、烏蘇酸、香樹脂醇，是一種弱酸性五環(huán)三萜類化合物，分子式為C30H48O3，在自然界分布廣范，多以游離或與糖結合成苷的形式存在于沙棘、女貞子、山楂、蔓越莓、枇杷葉等植物中，是多種植物的主要功能成分[5]。目前研究已發(fā)現(xiàn)UA不僅具有抗炎、抑菌、抗氧化、免疫調節(jié)等多種生物學效應，而且具有活性強、安全性高、毒性低（口服半數致死量為8 330 mg/kg）等特性[6-8]。Saravanan等[9]的研究還發(fā)現(xiàn)，UA對酒精性肝損傷有保護作用，但機制不明。已有文獻報道酒精性肝損傷常伴有腸道菌群失調癥狀[10-11]，且該類患者常出現(xiàn)內毒素血癥。本研究以腸道菌群為著眼點，探討UA對酒精性肝損傷的保護機制。調節(jié)腸道菌群可以防止革蘭氏陰性菌的過量繁殖，進而避免內毒素水平過高對肝臟進行的“二次傷害”[5]。本研究應用基因間重復共有序列（enterobacterial repetitive intergenic consensus，ERIC）-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）和PCR-變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）指紋圖譜分析以及實時熒光PCR技術等方法，探討UA對酒精性肝損傷大鼠腸道菌群的影響，以期為后續(xù)UA對酒精性肝損傷的保護作用機制研究提供可參考的依據，同時也為酒精性肝損傷的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

2 月齡雄性Wistar大鼠，SPF級，30 只，體質量180～200 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動物合格證號：SCXK（魯）20140001。

UA（純度98%） 長沙麓園生物科技有限公司；血清谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒南京建成生物工程研究所；內毒素檢測顯色基質鱟試劑盒廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 上海迪奧生物科技有限公司；糞便總DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通PCR試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物 上海英俊公司；標準菌株 廣東省食品微生物安全工程技術研究開發(fā)中心；定量PCR試劑盒 大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設備

ELx808型酶標儀 美國BioTek公司；PCR儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；實時熒光定量PCR擴增儀、微量紫外分光光度計 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及樣本采集

大鼠適應性喂養(yǎng)7 d之后，按體質量隨機分成3 組，每組10 只，分別為正常對照組、酒精模型組、UA干預組。正常對照組每日給予生理鹽水灌胃1 次，持續(xù)8 周；酒精模型組給予體積分數50%酒精8 mL/（kg·d）灌胃2 周，第3周把酒精劑量提高至12 mL/（kg·d），持續(xù)灌胃6 周；UA干預組每日給予150 mg/（kg·d） UA，1 h后再給予酒精灌胃，劑量同模型組。各組大鼠自由進食和飲水，實驗持續(xù)8 周。末次灌胃12 h后，10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔麻醉，腹主動脈取血。剝離肝臟組織，一部分用于病理學分析，剩余部分肝臟-80 ℃凍存?zhèn)溆?。此外，用無菌棉簽從結腸留取新鮮糞便3～5 g充滿無菌標本盒，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 檢測指標

1.3.2.1 肝臟組織HE染色觀察

新鮮大葉肝相同部位組織1 塊（約0.9 cm×0.9 cm×0.5 cm），體積分數10%中性甲醛緩沖液固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學變化。

1.3.2.2 血清轉氨酶活力檢測

采用賴氏法檢測各組大鼠血清ALT和AST活力，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.2.3 大鼠血漿中D-LA濃度和內毒素水平檢測

采用ELISA法檢測血漿D-LA濃度，顯色基質鱟試劑盒檢測血漿內毒素水平，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2.4 糞便腸道菌群基因組總DNA提取

稱取180 mg糞便樣品，采用糞便基因組DNA提取試劑盒提取腸道菌群基因組總DNA，提取過程嚴格按照說明書操作。使用微量分光光度計和質量分數1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質量濃度和純度。

1.3.2.5 ERIC-PCR檢測

以腸道菌群基因組DNA為模板進行ERIC-PCR擴增。采用的通用引物序列為：上游引物：5’-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3’；下游引物：5’-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3’。采用5×TBE緩沖液制備1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，90 V電泳40 min。通過凝膠成像分析系統(tǒng)對DNA條帶進行拍照并分析結果，尋找各組樣品間的規(guī)律性變化，做出對腸道菌群結構變化的分析。

1.3.2.6 PCR-DGGE檢測

對腸道菌群總DNA 16S rDNA V3可變區(qū)擴增，采用的通用引物序列為：V3F+GC：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA C-3’，V3R+GC：3’-GGG GGC CTA CGG GAG GCA GCA G-5’，目的基因片段長度220 bp。使用DGGE凝膠制備裝置，40%～50%變性梯度膠，60 ℃恒溫點樣，100 V電泳300 min。應用Quantity One進行非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）聚類分析。

1.3.2.7 實時熒光定量PCR檢測

按照細菌DNA提取試劑盒提取4 種細菌DNA，并進行普通PCR擴增，按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行割膠回收，使用微量紫外分光光度計測定質量濃度計算拷貝數，制成102～109拷貝/μL的標準品，與樣品（100 ng/μL）一同使用96 孔板上樣。利用標準曲線（R2＞0.999）生成的公式以及機器測量的Ct值計算樣品拷貝數，各組之間進行比較。各菌目的片段長度以及退火溫度見表1。

表1 PCR引物信息和預期產物長度Table 1 Information on primers used in PCR and expected product length

1.4 統(tǒng)計分析

應用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行整理和分析。對符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料多組間比較，采用單因素方差分析，以表示，不同組間兩兩比較采用最小顯著性差異法-t檢驗；非正態(tài)或方差不齊的計量資料多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，以M（P25，P75）表示，不同組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 UA干預對酒精暴露大鼠肝臟組織病理學改變的影響

圖1 HE染色觀察大鼠肝臟組織的病理學改變（400×）Fig. 1 Pathological observation of liver tissue by HE staining in rats (400 ×)

如圖1所示，正常對照組大鼠肝小葉結構清晰，肝板排列整齊，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列（圖1A）；酒精模型組大鼠肝小葉結構模糊，肝細胞大片性壞死，胞質中可見大小不等、數量不一的圓形脂肪空泡，壞死區(qū)可見炎性細胞浸潤（圖1B）。而UA干預組肝小葉結構雖有不同程度破壞，但與酒精模型組相比較，肝索排列逐漸恢復整齊（圖1C）。

2.2 UA干預對酒精誘導肝損傷大鼠血清轉氨酶活力的影響

表2 UA對酒精性肝損傷大鼠血清轉氨酶活力的影響Table 2 Effects of UA on serum aminotransferase level in alcohol-treated rats

如表2所示，酒精模型組血清轉氨酶水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），而UA干預組較酒精模型組ALT和AST活力均顯著降低（P＜0.05）。

2.3 UA對酒精性肝損傷大鼠血漿中D-LA濃度和內毒素水平的影響

表3 UA對酒精性肝損傷大鼠血漿D-LA濃度和內毒素水平的影響Table 3 Changes in plasma D-LA and endotoxin in rats from different groups

由表3可知，大鼠給予50%酒精連續(xù)灌胃8 周后，酒精模型組大鼠血漿D-LA濃度和內毒素水平顯著高于正常對照組（P＜0.05），分別為正常對照組的1.6、1.5 倍；而UA干預后可明顯抑制酒精所致的血漿D-LA濃度和內毒素水平的升高（P＜0.05）。

2.4 大鼠腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜分析

圖2 大鼠糞便腸道菌群ERIC-PCR指紋圖譜分析Fig. 2 ERIC-PCR fingerprint of gut microbes in rats from different groups

如圖2所示，酒精模型組大鼠腸道菌群明顯區(qū)別于空白對照組大鼠，在1 000 bp左右有清晰明亮的條帶1，而UA干預組該條帶則較暗，接近正常水平；約在250 bp處空白組較酒精模型組有較亮的條帶2，UA干預組該條帶亮度介于二者之間。

2.5 大鼠糞便總DNA PCR-DGGE指紋圖譜分析

圖3 糞便微生物總DNA 16S rDNA V3可變區(qū)PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 3 Gel electrophoresis of PCR products of V3 variable region of 16S rDNA gene sequence from total genomic DNA in gut microbes

圖4 DGGE圖譜中腸道菌群的變化（A）以及UPGMA聚類分析（B）Fig. 4 Changes in gut microbes by DGGE (A) and UPGMA cluster analysis (B) in two groups

如圖3所示，對各組大鼠糞便微生物總DNA 16S rDNA V3可變區(qū)進行PCR擴增及1%的瓊脂糖凝膠電泳，產物長度為220 bp。將擴增產物進行DGGE得到指紋圖譜，進行UPGMA聚類分析（圖4），可見酒精模型組與其他兩組相似系數僅為0.21，UA干預組與正常對照組相似系數為0.46。酒精模型組大鼠腸道菌群多樣性明顯下降且與正常組的相似性較低，而UA干預組大鼠腸道菌群結構與正常組大鼠更相似。

2.6 糞便中特定菌株的定量分析

表4 UA對酒精暴露大鼠腸道菌群特定菌株的定量分析（M（P25，P75），n＝10）Table 4 Quantities of gut microbes in rats from different groups(M(P25, P75), n= 10)拷貝/μL

如表4所示，與正常對照組比較，酒精模型組大鼠糞便中大腸桿菌和糞腸球菌數量均明顯增多（P＜0.05）；而UA干預組大腸桿菌和糞腸球菌數量較酒精模型組顯著減少（P＜0.05），且與正常對照組大鼠間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。此外，酒精模型組大鼠糞便中長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌數量與正常對照組相比均顯著降低（P＜0.05），而UA干預后可以明顯抑制這種變化，使兩種腸道菌群更趨近于正常對照組。

3 討 論

腸道菌群指腸道正常微生物群，它們按照一定規(guī)律分布在腸道內，與腸黏膜共同形成防御屏障[12]?，F(xiàn)有研究表明，長期過量飲酒可使腸道微生物群組成和分布發(fā)生紊亂，腸道內有益菌數量減少，有害菌繁殖增多，進而引起內毒素大量分泌，破壞腸黏膜滲透入血，誘發(fā)內毒素血癥，最終導致肝臟損傷[4,11]。

肝臟病理學檢查是反映肝損傷程度最直觀的證據，也是臨床常用的金標準。ALT與AST活力是檢測肝臟損傷的最敏感指標，可以在一定的范圍內反映生物體內肝細胞的損傷程度大小。各種急性病毒性肝炎、藥物或酒精引起急性肝細胞損傷時，血清ALT活力最敏感，在臨床癥狀如黃疸出現(xiàn)之前ALT活力就急劇升高，同時AST活力也升高[13]。本研究結果顯示，UA干預能夠改善肝臟組織病理學改變，同時有效抑制大鼠血清轉氨酶的釋放，從而對酒精誘導的肝損傷起到保護作用，這與Caignin等[6]的報道一致。D-LA是腸道多種細菌發(fā)酵的終代謝產物。正常情況下血清D-LA在人體內含量很低，但當腸道通透性的增加時，可導致D-LA涌入血液循環(huán)[14]。因此，D-LA常被認為是腸道通透性增加的敏感性指標之一[15-16]。內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的一種脂多糖和微量蛋白質的復合物。酒精除了能夠直接激活toll樣受體（toll-like receptor，TLR）信號通路引起肝損傷，還能夠增加變形菌及革蘭氏陰性菌的數量，進而導致內毒素產量增高。過量的內毒素破壞腸黏膜入血，通過門靜脈進入肝臟，與肝細胞上的TLR4結合，啟動一系列信號轉導，造成肝損傷[17]。臨床上發(fā)現(xiàn)重癥的酒精性肝炎會常常伴有內毒素血癥，Parlesak等[18]發(fā)現(xiàn)酒精肝病患者血液中內毒素水平是正常人的5 倍。本實驗通過對D-LA和內毒素檢測結果的分析可知：酒精模型組大鼠血中D-LA濃度和內毒素水平均顯著升高，經過8 周UA干預后，這種升高明顯得到抑制，提示長期大劑量酒精攝入可能導致大鼠腸道內微生態(tài)失衡，腸黏膜受損，腸通透性增加，進而誘發(fā)腸源性內毒素血癥的發(fā)生，最終導致肝損傷的發(fā)生或加重；而UA的補充可改善腸黏膜屏障，減少內毒素的產生和釋放，從而有效緩解肝臟損傷。

近年來的研究已發(fā)現(xiàn)酒精可引起腸道菌群的失衡，因此越來越多的人開始關注酒精性肝損傷的發(fā)生與腸道菌群失衡的關系[19-21]。本研究通過3 組間的對比進行酒精性肝損傷大鼠腸道菌群結構分析，以往對腸道菌群結構的認識常采用傳統(tǒng)生物培養(yǎng)技術，但因腸道內約90%的微生物不能在體外培養(yǎng)，因此不能客觀評價腸道微生物群落的變化規(guī)律[22]。ERIC-PCR和PCR-DGGE技術是目前被廣泛用于腸道結構及種群變化的分子生物學方法，其靈敏度和可靠性較好，且能克服傳統(tǒng)培養(yǎng)技術費時、費力及培養(yǎng)過程中菌種比例發(fā)生變化等缺點[23-25]。本實驗通過對3 組大鼠腸道菌群基因ERIC-PCR指紋圖譜觀察可見酒精性肝損傷大鼠的腸道菌群明顯區(qū)別于健康大鼠，而UA干預后的大鼠腸道菌群結構更加接近于正常對照組。PCR-DGGE結果顯示酒精使腸道菌群種類及數量發(fā)生明顯變化，多樣性降低，且與其他兩組相似度較低；而UA干預組與空白對照組相似度較高，更加直觀的表明UA補充對腸道菌群的調節(jié)作用。16S rDNA為編碼16S rRNA的基因，存在于所有細菌染色體基因組中，是細菌分類學研究中最常用、最有用的“分子鐘”，其種類少、含量大（約占細菌DNA含量的80%）、分子大小適中，可變區(qū)因細菌而異，變異程度與細菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關。因此，16S rDNA是細菌菌落結構分析最常用的系統(tǒng)進化標記分子[22,26-28]。本研究采用16S rDNA實時熒光定量PCR技術，檢測酒精暴露大鼠糞便中4 種具有代表性的細菌，包括大腸桿菌、糞腸球菌、嗜酸乳桿菌與長雙歧桿菌[29]。結果顯示：酒精攝入后隸屬革蘭氏陰性桿菌的大腸桿菌與糞腸球菌數量顯著升高，放線菌門的長雙歧桿菌和厚壁菌門的嗜酸乳酸桿菌數量顯著下降，這一結果與Bull-Otterson等[30]的研究結果相似，說明酒精可以引起腸道菌群的失衡；但UA干預后可見大鼠糞便中大腸桿菌數量明顯下降（P＜0.05），而長雙歧桿菌與嗜酸乳酸桿菌數量顯著回升（P＜0.05），與酒精模型組形成鮮明對比。上述結果均提示UA可調節(jié)腸道菌群，防止腸道內菌群失衡，進而發(fā)揮改善酒精性肝損傷的作用。

綜上所述，長期大劑量酒精攝入可能導致腸道黏膜通透性增大，大鼠腸道內微生態(tài)失衡，加速內毒素釋放，最終加重肝細胞損傷；補充UA可能通過調節(jié)酒精性肝損傷大鼠腸道菌群結構和數量，修復腸黏膜細胞屏障，減少內毒素的產生和釋放，改善腸道微生態(tài)，從而達到有效緩解肝細胞損傷的功效。

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