高 原，王福玲，賈 琦，劉 微，周艷巖，張曉萌，咸玥桐

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076）

降香檀（Dalbergia odorifera T. Chen）為豆科檀屬植物，別名降香、花梨木，是國家二級保護(hù)植物[1-3]。降香檀（簡稱降香）的樹干和根的干燥心材降香為我國傳統(tǒng)中藥，多用于脘腹疼痛，跌撲損傷，外傷出血的治療，常與其他活血化瘀藥配伍用于心血管疾病的治療[4-6]。降香的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油類和黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其成分具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗凝血、抗高血脂、舒張血管、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抑制白細(xì)胞三烯生物合成等作用[7-10]。降香資源日益緊缺，生長周期長，分布受到地域限制并在一定程度上受環(huán)境的影響。如果直接以降香為研究對象，從降香中提取分離活性成分，會面臨著破壞植物資源、采集困難、耗時耗力等諸多難題。為了解決這些問題，本研究將目光轉(zhuǎn)向降香內(nèi)生真菌。內(nèi)生真菌作為豐富的次生代謝產(chǎn)物的天然藥庫，有著巨大的開發(fā)潛能。如果利用植物內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物，能夠降低成本、節(jié)約資源，對保護(hù)環(huán)境亦有重大貢獻(xiàn)。

自由基是生物體內(nèi)生命活動的一種正常代謝產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體處于正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于一種動態(tài)的平衡狀態(tài)[11-12]，然而當(dāng)某種原因打破這種動態(tài)的平衡后，自由基就會導(dǎo)致組織細(xì)胞的氧化損傷并引發(fā)多種疾病[13-14]。這種過氧化反應(yīng)在某些化合物的作用下，是可以逆轉(zhuǎn)的，抗氧化劑即能防止這一現(xiàn)象的產(chǎn)生。由于人工合成抗氧化劑在生物體內(nèi)沉降積累，不易分解，容易對機(jī)體造成損傷，所以天然抗氧化劑的開發(fā)和應(yīng)用越來越受到人們的關(guān)注。丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）是肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，MDA的測定可以用于評價氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）能清除超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，其活力反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力。谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）能夠有效清除脂質(zhì)和其他的有機(jī)氫過氧化物，是氧化應(yīng)激中發(fā)揮保護(hù)作用的重要酶[15-17]。以上酶及相關(guān)產(chǎn)物的檢測往往是抗氧化活性評價的重要指標(biāo)。

本研究通過從降香中分離內(nèi)生真菌，并初步篩選獲得一株抗氧化活性較好的菌株，并對其進(jìn)行分類鑒定。擬通過構(gòu)建HepG2細(xì)胞氧化損傷模型，觀察降香內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為探討其抗氧化損傷機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

降香新鮮植株，購自廣東省廣州市老果農(nóng)實(shí)驗(yàn)基地；HepG2細(xì)胞，哈爾濱商業(yè)大學(xué)細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所保存。

染料木素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 上海伊卡生物技術(shù)有限公司；白藜蘆醇（純度≥98%） 西安玉泉生物科技有限公司；氨芐青霉素 美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 北京中生瑞泰科技有限公司；MDA、SOD和GSH-Px試劑盒 南京建成生物工程研究所；次氯酸鈉 西隴化工股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂粉 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；酵母浸粉 安琪酵母股份有限公司；葡萄糖 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HH-2型恒溫水浴箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱、生化培養(yǎng)箱、BP-9082型精密恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BSA6202S-CW電子分析天平、PB-10 pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；XSP-12CD型光學(xué)顯微鏡上海滬杏光學(xué)儀器有限公司；1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Agilent公司；AB Sciex API3000質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀（三重四極桿串聯(lián)MS檢測器）美國SCIEX公司；ELx800酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；CO2培養(yǎng)箱 德國Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 降香內(nèi)生真菌的分離與培養(yǎng)

新鮮降香樹皮，洗滌劑洗凈表面污垢，清水沖洗。無菌條件下進(jìn)行組織表面消毒：75%的乙醇100 mL浸泡1 min，無菌水漂洗2～3 次，10%的NaClO 100 mL溶液分別浸泡5 min，無菌水100 mL漂洗2～3 次，每次1 min，最后用無菌濾紙吸干表面水分，備用[18-19]。將降香樹皮用鑷子撕下并剪成適宜大小的組織塊，放置于氨芐青霉素終質(zhì)量濃度為100 μg/mL的PDA培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～10 d，以最后一次無菌水涂抹印記作為陰性對照。待長出真菌后，挑去尖端菌絲，反復(fù)純化，保存?zhèn)溆谩?/p>

將已純化的降香內(nèi)生真菌菌種活化后，接種于200 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)2 周后，菌種4 層紗布過濾后烘干，乙酸乙酯浸提，發(fā)酵培養(yǎng)液乙酸乙酯萃取后，二者合并后濃縮得浸膏，溶于1 mL甲醇備用。

1.3.2 降香內(nèi)生真菌的抗氧化活性篩選

通過DPPH清除自由基實(shí)驗(yàn)對降香內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抗氧化活性進(jìn)行篩選。按下式計(jì)算DPPH自由基清除率。用無水乙醇做空白對照[20]。

式中：Ac為無水乙醇+DPPH的吸光度；A0為樣品+無水乙醇+DPPH的吸光度。

1.3.3 降香內(nèi)生真菌的鑒定

真菌總DNA提取采用CTAB法[21]，以ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）為引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）獲得ITS-rDNA擴(kuò)增片段[22-23]。PCR體系（50 μL）：5 μL 10×PCR buffer、4 μL 25 mmol/L MgCl2、4 μL 2.5 mmol/L dNTP、5 μL 0.5 μmol/L上游引物、5 μL 0.5 μmol/L下游引物、0.2 μL 5 U/μL Taq酶、26.8 μL無菌去離子水。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)。DNA片段回收純化后送往上海生物工程有限公司測序，所得結(jié)果在GenBank上進(jìn)行同源性比對，并利用軟件MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株分類地位[24]。

1.3.4 降香內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物檢測

精確稱量內(nèi)生真菌乙酸乙酯萃取物溶于色譜甲醇，質(zhì)量濃度為10 μg/mL，0.22 μm濾膜過濾。采用HPLCMS/MS法檢測[25]。色譜條件：色譜柱：HiQ SiL C18柱，250 mm×4.6 mm；流動相：甲醇-水（含1%的甲酸），梯度洗脫：91%甲醇0～10 min，91%～57%甲醇10～25 min，57%～91%甲醇25～40 min；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，用染料木素標(biāo)準(zhǔn)品做對照。質(zhì)譜條件：離子源為ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測負(fù)離子掃描，離子噴霧電壓-4 500 V，去簇電壓、碰撞電壓、入口電壓和出口電壓分別為-60、-25、-10、-5 V。用于分析的染料木素離子質(zhì)荷比（m/z）為269.1～133.0。

1.3.5 內(nèi)生真菌產(chǎn)物對H2O2誘導(dǎo)肝細(xì)胞抗氧化酶活力等指標(biāo)的影響

取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，每孔1×104細(xì)胞，培養(yǎng)約12 h后，分為陰性對照組、陽性對照組和不同質(zhì)量濃度的內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物組。陰性對照組不加受試物；陽性對照組只加入200 μmol/L H2O2干預(yù)6 h，內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物組分別加入的質(zhì)量濃度為0、1、5、10、20、40 μg/mL預(yù)處理12 h，各代謝產(chǎn)物組再加入200 μmol/L H2O2作用6 h，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。干預(yù)結(jié)束后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗2 次，然后每孔加入1% Triton100的磷酸鹽緩沖液0.5 mL，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后2 000 r/min離心10min取得上清液，參照試劑盒要求，測定細(xì)胞中MDA水平、SOD、GSH-Px活力等相關(guān)氧化損傷的指標(biāo)[26-28]。陽性對照藥選取白藜蘆醇（0～40 μg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用方差分析并行方差齊性檢驗(yàn)；結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 降香內(nèi)生真菌的分離及抗氧化活性篩選

通過組織表面消毒法初步從降香樹皮部分離獲得內(nèi)生真菌83 株，通過DPPH自由基清除率實(shí)驗(yàn)，對稀釋不同倍數(shù)（0.031×、0.063×、0.13×、0.25×、0.50×和1.00×）的內(nèi)生真菌發(fā)酵濃縮液進(jìn)行了檢測，初步篩選獲得了一系列抗氧化活性較好的內(nèi)生真菌，其中內(nèi)生真菌JXP21抗氧化活性最佳，計(jì)算得其半數(shù)抑制濃度為0.052×內(nèi)生真菌濃縮液。

2.2 降香內(nèi)生真菌的鑒定

圖1 降香內(nèi)生真菌JXP21 ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)育分析Fig. 1 Phylogenetic tree analysis of endophyte JXP21 based on ITS sequence

通過對菌株JXP21進(jìn)行DNA的提取及PCR擴(kuò)增回收，測序獲得菌株JXP21的ITS-rDNA序列，用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比較，從中獲得與該菌株序列相近種屬的ITS-rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)合真菌形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)比對結(jié)果（圖1），菌株JXP21鑒定為鏈格孢菌（Alternaria alternata），與Alternaria alternata（KP979753.1）具有100%的相似性。

2.3 降香內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的檢測

圖2 降香內(nèi)生真菌JXP21次生代謝產(chǎn)物的HPLC-MS/MS檢測Fig. 2 HPLC-MS/MS analysis of secondary metabolites from JXP21

圖3 降香內(nèi)生真菌JXP21次生代謝產(chǎn)物的MS檢測Fig. 3 Mass spectra of secondary metabolites from JXP21

采用HPLC-MS/MS成對捕捉檢測結(jié)果顯示，在內(nèi)生真菌JXP21的乙酸乙酯層中，檢測出了染料木素，出峰時間為14.74 min，m/z 269.1～133.0（圖2），一級、二級質(zhì)譜圖如圖3所示。染料木素（genistein）為異黃酮的一種，它具有弱雌激素活性、抗癌、預(yù)防心血管疾病等功能，此外，還具有抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制真菌活性及酪氨酸蛋白激酶活性的功能[29-30]，通常存在豆科植物中，也在降香中存在。在內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物中檢測得到染料木素可能與其宿主環(huán)境的影響有關(guān)，內(nèi)生真菌JXP21的抗氧化活性也可能受到染料木素的影響。

2.4 降香內(nèi)生真菌萃取物對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞抗氧化酶活力的影響

圖4 降香內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞MDA水平的影響Fig. 4 Effect of metabolites from JXP21 on MDA level in HepG2 cells

圖5 降香內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞SOD活力的影響Fig. 5 Effect of metabolites from JXP21 on SOD activity in HepG2 cells

圖6 降香內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對HepG2細(xì)胞GSH-Px活力的影響Fig. 6 Effect of metabolites from JXP21 on GSH-Px activity in HepG2 cells

與空白對照組比較，H2O2誘導(dǎo)模型組細(xì)胞懸液中SOD活力明顯降低，GSH-Px活力明顯下降，MDA水平明顯升高。內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物作用于HepG2細(xì)胞后，與模型組相比，能夠降低H2O2誘導(dǎo)損傷引起的MDA含量的升高，MDA含量由4.65 nmol/mg pro下降為3.68 nmol/mg pro。提高SOD和GSH-Px活力，SOD活力由6.88 U/mg pro升高至8.64 U/mg pro，GSH-Px活力由8.45 U/mg pro升高至9.68 U/mg pro。且變化趨勢均呈明顯的劑量依賴性（圖4～6）。與陽性對照白藜蘆醇（0～40 μg/mL）結(jié)果呈現(xiàn)一致性，白藜蘆醇作用HepG2細(xì)胞后，MDA含量下降1.82 nmol/mg pro，SOD活力上升1.53 U/mg pro，GSH-Px活力上升2.13 U/mg pro。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過組織表面消毒法，從降香樹皮中分離出大量內(nèi)生真菌，初步篩選獲得一株具有良好抗氧化活性的降香內(nèi)生真菌JXP21。通過分子生物學(xué)方法，對內(nèi)生真菌JXP21進(jìn)行了鑒定，系統(tǒng)發(fā)育分析初步判定JXP21為鏈格孢菌。進(jìn)一步對JXP21擴(kuò)大培養(yǎng)，富集純化代謝產(chǎn)物，通過HPLC-MS/MS檢測，初步檢測出一種活性成分——染料木素，推測該菌株活性與該化合物有一定的關(guān)系。在內(nèi)生真菌JXP21代謝產(chǎn)物對H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究中表明，適當(dāng)質(zhì)量濃度的降香內(nèi)生真菌JXP21代謝產(chǎn)物能抑制H2O2所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，JXP21代謝產(chǎn)物對H2O2所致的肝細(xì)胞損傷有明顯的抗氧化作用，能夠提高HepG2細(xì)胞的SOD和GSH-Px的活力，降低MDA含量，表明內(nèi)生真菌JXP21代謝產(chǎn)物對肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。關(guān)于內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的研究目前已經(jīng)較為成熟，但是關(guān)于降香內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的研究目前報道較少，對降香這種國家二級保護(hù)植物的內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)，不僅為降香資源的開發(fā)和利用提供了新途徑，也為該藥用植物及其其內(nèi)生真菌之間的關(guān)系提供了一定的理論依據(jù)。本課題組也將繼續(xù)對降香內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究與探討，對次生代謝產(chǎn)物的抗氧化機(jī)制進(jìn)一步深入的研究。

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