納米金屬氧化物對(duì)土壤酶活性的影響研究進(jìn)展

石清清，鄧代莉，顏椿，蒲生彥,3,

1. 地質(zhì)災(zāi)害防治與地質(zhì)環(huán)境保護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都理工大學(xué))，成都 610059 2. 國(guó)家環(huán)境保護(hù)水土污染協(xié)同控制與聯(lián)合修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610059 3. 香港理工大學(xué)土木及環(huán)境工程學(xué)系，中國(guó)香港

近年來，伴隨納米技術(shù)的飛速發(fā)展，人工納米金屬氧化物(engineered nanometal oxide particles，ENOPs，其尺度界定為1～100 nm)，如納米TiO2、ZnO、Al2O3、Fe2O3、CeO2等，在電子、生物醫(yī)藥、化工催化和新材料開發(fā)等各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[1]。由于ENOPs在環(huán)境中的暴露程度，其是否具有生物毒性引起了各領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者的廣泛關(guān)注[2]。ENOPs在生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用過程中會(huì)不可避免地釋放到土壤環(huán)境中，與土壤介質(zhì)中的各種組分發(fā)生物理、化學(xué)或生物反應(yīng)，這些遷移轉(zhuǎn)化過程會(huì)改變納米顆粒的團(tuán)聚程度、溶解速率、粒徑大小或形狀、表面積、表面電荷和表面化學(xué)性質(zhì)等特征，從而影響納米顆粒的環(huán)境行為及生物毒性[3]。

土壤酶是一種具有生物催化能力和蛋白質(zhì)性質(zhì)的高分子活性物質(zhì)[4]。土壤酶參與土壤中各種化學(xué)反應(yīng)和生物化學(xué)過程，與有機(jī)物質(zhì)礦化分解、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素循環(huán)、能量轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[5-6]。土壤酶活性不僅能反映土壤微生物活性高低、表征土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和運(yùn)移能力強(qiáng)弱[4]、評(píng)價(jià)土壤肥力[7]和土壤環(huán)境質(zhì)量[8]，也可作為評(píng)價(jià)ENOPs土壤污染的生物學(xué)指標(biāo)。ENOPs的小尺寸、高比表面積等特性會(huì)增強(qiáng)其在土壤中的擴(kuò)散程度與遷移能力并促進(jìn)與土壤游離酶或底物的的接觸和作用，從而可能對(duì)土壤酶的活性產(chǎn)生影響[2]。

本文通過大量文獻(xiàn)調(diào)研和分析，較系統(tǒng)地回顧和總結(jié)了ENOPs對(duì)土壤酶活性的影響相關(guān)研究，并對(duì)未來研究方向和重點(diǎn)做了展望，ENOPs與土壤酶活性間的劑量-效應(yīng)關(guān)系可支撐相關(guān)環(huán)境基準(zhǔn)的研究。

1 納米金屬氧化物概述(Nano-metal oxide particles overview)

1.1 納米氧化物的性質(zhì)與用途

納米金屬氧化物顆粒具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，表現(xiàn)出與同組成的微米晶體材料完全不同的熱學(xué)性能、磁學(xué)性能、電學(xué)性能、光學(xué)性能、力學(xué)性能及化學(xué)活性等[9]。由于具備上述諸多特性，ENOPs已廣泛應(yīng)用于催化劑、遮光劑、傳感器及化妝品等領(lǐng)域，備受研究者的關(guān)注[10]。目前常見的ENOPs主要有SiO2、TiO2、ZnO、CuO、CeO2、Fe3O4、A12O3等。比如，TiO2NPs由于具備特殊的光學(xué)性質(zhì)和良好的化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用于抗紫外材料、紡織、光催化觸媒、防曬霜、涂料、食品包裝材料、造紙及航天工業(yè)中[11]；ZnO NPs則由于其高效的UV吸收能力及對(duì)可見光的透過能力而常用于個(gè)護(hù)用品及遮光材料的制作[12]；CuO NPs由于其高溫超導(dǎo)能力、電子相關(guān)效應(yīng)及動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)能力被廣泛應(yīng)用于半導(dǎo)體制作、催化劑及細(xì)胞顯影技術(shù)[13]。

1.2 ENOPs在土壤中的環(huán)境行為

土壤是包括ENOPs在內(nèi)的各種污染物進(jìn)入環(huán)境后的主要?dú)w宿，又是環(huán)境污染鏈中重要的傳遞環(huán)節(jié)。納米金屬氧化物可通過多種途徑進(jìn)入土壤中，如大氣中ENOPs的沉降，含納米材料工業(yè)廢渣、城市垃圾的填埋、棄置，含納米材料廢水和污水灌溉等。ENOPs進(jìn)入環(huán)境后，在環(huán)境介質(zhì)中發(fā)生遷移轉(zhuǎn)化，與環(huán)境及環(huán)境中的生物體相互作用并被吸收富集，直接或間接威脅生態(tài)系統(tǒng)及人類健康[14]。由于ENOPs具有廣譜抑菌作用，且對(duì)生物體毒性遠(yuǎn)大于碳納米材料，其生物安全性問題日益受到關(guān)注[15]。ENOPs在土壤中發(fā)生的主要物理變化是聚集或團(tuán)聚?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化包括氧化還原、離子溶出、硫化與磷酸化、大分子物質(zhì)或有機(jī)/無機(jī)配體的修飾。此外，土壤環(huán)境中活性最高、成分最復(fù)雜的微生物亦會(huì)對(duì)納米顆粒的形態(tài)及環(huán)境效應(yīng)產(chǎn)生影響。

2 對(duì)土壤酶活性的影響研究(Effects of ENOPs on soil enzyme activity)

2.1 對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶主要涉及氧化還原酶類、水解酶類、轉(zhuǎn)移酶類與裂解酶類，來源于土壤微生物活動(dòng)分泌、植物根系分泌和植物殘?bào)w以及土壤動(dòng)物分解，是研究土壤生態(tài)系統(tǒng)不可或缺的關(guān)鍵性指標(biāo)[7,16-17]。ENOPs進(jìn)入土壤環(huán)境后，會(huì)與土壤介質(zhì)中的各種組分發(fā)生物理、化學(xué)或生物反應(yīng)，這些轉(zhuǎn)化過程會(huì)不同程度影響土壤中的生化反應(yīng)進(jìn)程及土壤中酶活性[18-19]。根據(jù)以往研究報(bào)道，典型ENOPs如ZnO NPs、TiO2NPs、CuO NPs、CeO2NPs及鐵系納米氧化物等對(duì)土壤酶活性的影響主要聚焦在脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶的活性變化上，具體見表1所示。

2.2 影響土壤酶活性的主要途徑

ENOPs對(duì)土壤酶活性的影響主要通過3種途徑：釋放有毒金屬離子、改變土壤中酶或?qū)?yīng)底物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、損傷生物體細(xì)胞，如圖1所示。ENOPs對(duì)土壤酶活性的影響可能是單一途徑，也可能是2種或3種途徑的共同作用。

2.2.1 釋放有毒金屬離子

ENOPs，特別是一些易于釋放出有毒金屬離子的納米材料(如ZnO、CuO納米顆粒)，主要通過釋放金屬離子影響土壤酶活性。一般情況下，ENOPs進(jìn)入土壤環(huán)境后金屬離子并不會(huì)完全溶出，以納米形式存在的ENOPs與釋放的有毒金屬離子對(duì)土壤酶活性影響的貢獻(xiàn)率尚不清楚。

2.2.2 改變酶或底物的形態(tài)結(jié)構(gòu)

土壤酶催化功能通過蛋白質(zhì)分子間相互作用來實(shí)現(xiàn)，由于ENOPs結(jié)構(gòu)和尺寸與蛋白質(zhì)分子相似，可能會(huì)引起生物學(xué)識(shí)別、反應(yīng)的混淆和異常，使土壤酶的結(jié)構(gòu)和功能紊亂。

圖1 ENOPs對(duì)土壤酶的作用途徑注：a) 釋放有毒金屬離子；b) 改變酶或底物的形態(tài)結(jié)構(gòu)；c) 損傷生物體細(xì)胞。Fig. 1 Effects of ENOPs on soil enzymeNote: a) the release of toxic metal ions; b) alteration of the morphological structure of the enzyme or substrate; c) damage to the organism cells.

ENOPs進(jìn)入土壤后，在難以溶出金屬離子且不損傷土壤生物體的情況下則認(rèn)為ENOPs通過改變酶或底物的形態(tài)結(jié)構(gòu)作用于土壤酶。ENOPs如TiO2NPs、CeO2NPs、Fe3O4NPs等在土壤中分散性好、顆粒尺寸小、比表面積大，難以溶出且具有較高的活性，容易與底物結(jié)合并發(fā)生相互作用。Du等[2]進(jìn)行原位實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，外源添加納米TiO2，土壤的鈦離子含量幾乎無變化，土壤蛋白酶、過氧化氫酶以及過氧化物酶受到抑制，土壤脲酶活性顯著增強(qiáng)。有研究表明，TiO2NPs處理濃度高達(dá)1 000 mg·kg-1時(shí)，脲酶活性顯著提高，磷酸酶的活性受到嚴(yán)重抑制[21]。在劉啟明等[29]的研究中，納米TiO2也對(duì)蛋白酶活性有抑制作用，且添加劑量越高，抑制程度越大。有研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)添加納米TiO2后，激活了抗氧化酶活性，如過氧化氫酶、過氧化物酶和超氧化物歧化酶等；添加納米CeO2后，抑制了脲酶、過氧化氫酶和FDA酶的活性，并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系[30]。方國(guó)東等[25]在向土壤施加了納米 Fe3O4顆粒后，脲酶活性增強(qiáng)，并存在顯著劑量效應(yīng)關(guān)系。這種現(xiàn)象是由于脲酶是一種分子量為48萬道爾頓的金屬酶，含有微量的順磁性鎳等過渡金屬原子或離子，起著輔基、輔酶或活性中心等作用[31]，當(dāng)添加Fe3O4NPs后，脲酶分子構(gòu)相在Fe3O4NPs磁性作用下會(huì)發(fā)生變形和扭曲，結(jié)構(gòu)和功能被改變，從而激活了自身酶活性。

ENOPs容易與酶分子活性中心結(jié)合，妨礙酶與底物的識(shí)別與相互作用。對(duì)于TiO2NPs、CeO2NPs等在土壤中不易溶出金屬離子且活性較高的納米顆粒，與土壤中的酶分子或底物分子結(jié)合改變其形態(tài)結(jié)構(gòu)，阻止酶與底物的特異性識(shí)別是這類納米氧化物影響土壤酶活性的主要途徑。

2.2.3 損傷生物體細(xì)胞

ENOPs可通過直接接觸或誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生造成膜損傷、DNA損傷和細(xì)胞信號(hào)受阻，這些方式會(huì)直接損傷微生物或動(dòng)植物體細(xì)胞，進(jìn)而影響微生物或動(dòng)植物分泌釋放土壤酶[32]。

ENOPs造成生物體過氧化損傷是最為普遍接受的一種毒性機(jī)制[33]，過氧化損傷是由活性氧引起的膜通透性改變及膜損傷[34]。Park等[35]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞核周圍存在納米TiO2顆粒時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)該區(qū)域活性氧的產(chǎn)生；活性氧的產(chǎn)生與細(xì)胞活性有很好的一致性，可以指示細(xì)胞毒性。韓爽等[36]報(bào)道了氧化銅納米顆粒會(huì)引起細(xì)菌、藻類、酵母、老鼠及人體細(xì)胞氧化應(yīng)激及DNA 損傷。Applerot等[37]發(fā)現(xiàn)納米CuO能促進(jìn)微生物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，迅速消耗腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)使細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)受阻，從而導(dǎo)致大量微生物死亡。金屬氧化物顆粒進(jìn)入土壤環(huán)境后，通過產(chǎn)生活性氧簇(ROS)，增加氧化壓力，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)陷、膜離子通道、細(xì)胞吞噬作用等進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部對(duì)植物根系和微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[38]。細(xì)胞膜或細(xì)胞器及DNA/RNA受損后，細(xì)胞合成酶的功能受損，土壤中相應(yīng)酶的合成和釋放減少，進(jìn)而影響其中生化反應(yīng)過程。

ENOPs可以聚集在土壤微生物膜上使細(xì)胞壁凹陷，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性改變。ENOPs還可能改變土壤微生物膜電位，使其細(xì)胞內(nèi)自由基數(shù)量增加，影響代謝過程與土壤中酶的合成與分泌[39-40]。

3 土壤酶活性的主要調(diào)控因子(Main regulators of soil enzyme activity)

ENOPs的土壤酶活效應(yīng)受顆粒本身和環(huán)境因素的影響。環(huán)境因素包括生物因子和非生物因子，生物因子主要是指土壤中的微生物和植物；非生物因子主要是指土壤的理化性質(zhì)，如有機(jī)質(zhì)含量、pH、水分含量等。

3.1 納米金屬氧化物的性質(zhì)

ENOPs兼具金屬和納米的雙重性質(zhì)，已有大量研究表明，多種納米氧化物材料具有抗菌作用[41-42]，對(duì)土壤微生物量及群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的擾動(dòng)，影響土壤酶的合成分泌過程。

ENOPs獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如比表面、尺寸效應(yīng)等會(huì)影響土壤酶的活性，但不是所有的納米氧化物與土壤酶之間都存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，應(yīng)明確不同納米氧化物的敏感酶活指標(biāo)。

3.2 土壤自身理化性質(zhì)

由于pH、有機(jī)質(zhì)組成及含量、粘土含量及礦物質(zhì)等均會(huì)對(duì)納米顆粒的環(huán)境行為及酶活性本身造成影響，土壤的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)納米氧化物顆粒的土壤酶活效起著調(diào)控作用[43-45]。

相同ENOPs添加到不同類型土壤后，由于土壤理化性質(zhì)的差異，納米氧化物對(duì)土壤酶的影響也有所不同。孫影等[43]發(fā)現(xiàn)，將納米TiO2添加到沙土、黑土、草炭土中后，微生物、酶、氮素含量在沙土中受到的影響最大，在草炭土中受到的影響最小，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是沙土中的有機(jī)質(zhì)含量比黑土和草炭土低，進(jìn)入土壤的TiO2NPs不易團(tuán)聚和被有機(jī)質(zhì)吸附，游離的TiO2NPs更易對(duì)土壤微生物和土壤酶活性造成影響。納米材料分散介質(zhì)中的電解質(zhì)種類可以調(diào)控CeO2NPs的抗菌性[46]，不同土壤中的電解質(zhì)種類有所差異，也會(huì)影響CeO2NPs在土壤中的微生物及酶活效應(yīng)。ENOPs施加進(jìn)入土壤內(nèi)后，會(huì)在一定程度上改變土壤理化性質(zhì)，間接影響土壤酶活性。金盛楊等[47]研究發(fā)現(xiàn)，將土壤溫室培養(yǎng)60 d后，納米四氧化三鐵(Fe3O4NPs)和納米氧化鐵(Fe2O3NPs)處理顯著降低了烏柵土銨態(tài)氮和紅壤有效磷的含量，略微降低了土壤pH。

土壤理化性質(zhì)，如pH、有機(jī)質(zhì)含量等會(huì)影響ENOPs在土壤中的遷移轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而影響土壤中納米顆粒的生物有效性和生物毒性。在評(píng)價(jià)ENOPs對(duì)土壤酶活性的影響過程中，需結(jié)合不同土壤的理化性質(zhì)加以考量。

3.3 土壤中的生物活動(dòng)

土壤中的植物及微生物活動(dòng)會(huì)影響ENOPs的聚集狀態(tài)和運(yùn)移過程，間接改變其生物有效性和酶活效應(yīng)[48-49]。

納米氧化物進(jìn)入土壤后，影響土壤微生物活動(dòng)分泌與植物根系分泌，從而影響微生物數(shù)量與群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而間接影響土壤酶的活性[50]。方國(guó)東等[25]研究發(fā)現(xiàn)，納米 Fe3O4對(duì)紅壤中的細(xì)菌和放線菌存在激活作用，且隨納米 Fe3O4投加量的增加，激活效應(yīng)逐漸增強(qiáng)；對(duì)紅壤中的真菌有抑制作用，抑制率與納米Fe3O4投加量呈正相關(guān)，從而激活了土壤中的淀粉酶、中性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶。根系分泌物是植物根系分泌或溢泌的各種離子和大量有機(jī)物質(zhì)，其組成和含量隨著環(huán)境而發(fā)生變化[51-52]。Xu等[53]認(rèn)為由于水稻根系發(fā)達(dá)，根際土壤中存在大量的植物殘?bào)w可為水解纖維素提供豐富的底物，從而促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，緩解CuO NPs對(duì)微生物細(xì)胞的毒害作用。

特定種類的植物或微生物菌劑能在一定程度上減弱ENOPs對(duì)土壤中酶活性的影響，緩解其對(duì)生物細(xì)胞的毒害作用。對(duì)于ENOPs富集程度較高的土壤，可以考慮植物修復(fù)或微生物修復(fù)方式。

4 結(jié)語與展望(Conclusion and prospect)

目前針對(duì)ENOPs環(huán)境行為和生物毒性的研究是一個(gè)新興活躍的研究領(lǐng)域，很多研究尚處于起步階段，理論基礎(chǔ)也相對(duì)缺乏，研究廣度與深度急需拓展與加強(qiáng)。關(guān)于ENOPs在水環(huán)境中的行為與生物毒性的研究已較為充足，而針對(duì)土壤環(huán)境及陸生植物的相關(guān)研究還較少并亟待開展。已有的ENOPs對(duì)土壤酶活性的影響多表現(xiàn)為抑制作用，但具體作用類型及程度受ENOPs的性質(zhì)、土壤理化性質(zhì)以及土壤生物活動(dòng)三者的調(diào)控。研究納米氧化物與土壤酶間的劑量-效應(yīng)關(guān)系可為相關(guān)環(huán)境基準(zhǔn)的研究提供理論依據(jù)，為環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論支撐。土壤酶作為土壤中幾乎所有反應(yīng)的參與者，研究ENOPs對(duì)土壤酶活性的影響對(duì)評(píng)估納米氧化物生態(tài)效應(yīng)和土壤環(huán)境環(huán)境質(zhì)量具有重要意義?，F(xiàn)有ENOPs在生物毒性和土壤微生物效應(yīng)方面的研究為評(píng)價(jià)納米氧化物在土壤中的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)積累了一定的基礎(chǔ)。已有的研究結(jié)論主要針對(duì)某些種類的ENOPs，并且依賴于實(shí)驗(yàn)室模擬或建模的結(jié)果，而非針對(duì)實(shí)際現(xiàn)有工程的研究。

隨著對(duì)ENOPs生物毒性研究逐步深入，其對(duì)土壤酶活性的影響應(yīng)在以下幾個(gè)方面進(jìn)一步完善和發(fā)展。1) 深入污染地塊進(jìn)行原位實(shí)驗(yàn)以彌補(bǔ)室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性，研究真實(shí)環(huán)境下ENOPs對(duì)土壤酶的作用機(jī)理。2) 建立ENOPs與土壤酶活性之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系，將不同納米材料的劑量與其對(duì)土壤的污染程度對(duì)應(yīng)起來，并篩選對(duì)ENOPs敏感性較強(qiáng)的土壤酶，構(gòu)建出更加科學(xué)合理的土壤酶學(xué)指標(biāo)，更全面準(zhǔn)確地反映納米氧化物對(duì)土壤酶的毒性效應(yīng)。3) ENOPs在土壤中的團(tuán)聚會(huì)影響土壤酶活性的變化，但不同團(tuán)聚程度對(duì)其影響機(jī)理尚不清楚，針對(duì)ENOPs團(tuán)聚特性及其對(duì)土壤酶活性影響的研究亟待開展。4) 考慮到土壤作為ENOPs釋放到環(huán)境中的匯，其污染具有復(fù)合性，未來的研究應(yīng)涉及多種人工納米材料復(fù)合污染對(duì)土壤酶的影響。5) ENOPs是一種環(huán)境背景值相對(duì)缺失的新興土壤污染物，尚待建立相關(guān)的環(huán)境基準(zhǔn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

通訊作者簡(jiǎn)介：蒲生彥(1981—)，男，博士(后)，教授，香江學(xué)者，四川省千人計(jì)劃特聘專家。目前主要從事水土污染協(xié)同控制、土壤地下水污染風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警及環(huán)境基準(zhǔn)相關(guān)的研究與教學(xué)工作。

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