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      體育場館內PM2.5暴露對運動大鼠行為學及相關無氧代謝酶活性的影響

      2018-06-19 02:38:16李峰
      生態(tài)毒理學報 2018年2期
      關鍵詞:染毒顆粒物機體

      李峰

      西安建筑科技大學體育學院,西安 710055

      PM2.5作為復合型大氣污染環(huán)境中的主要污染物,具有粒徑小、危害性大、比表面積大、累積性強、在空氣中停留時間長、運輸距離遠等特點[1]。由于其易被人體吸入至肺部,隨血液循環(huán)達到身體深部而引發(fā)疾病,長期在空氣污染的環(huán)境中進行體育運動,會加劇PM2.5對人體的傷害,使機體面臨更大的健康風險[2]。作為評判機體行為學的重要指標,卒中指數和神經病學癥狀評分對神經系統(tǒng)功能缺損的評定具有重要的作用[3]。糖代謝作為機體運動時重要的能量供應來源,其能量轉換速率與糖代謝限速酶的表達高度相關[4]。同時,限速酶本身受多種物理化學及生物因素的影響,從而對糖代謝的轉換起著加速或減緩的作用[5]。因此,通過研究不同濃度PM2.5暴露對運動行為學特點及機體糖代謝限速酶的影響及其機制,可以為探明PM2.5暴露劑量-運動反應-運動效能之間的關系提供一定的實驗參考,也可以為污染天氣應急計劃的制定和戶外體育活動的防護提供一定的依據。

      1 材料與方法(Materials and methods)

      1.1 PM2.5的采樣及懸液制備

      PM2.5收集采用顆粒物智能采樣器進行,地點為某高校綜合體育館內,為使采樣不受影響,樣品采集時對周圍器械及其他物品進行清理,以保證空氣通道暢通。同時為了模仿人體呼吸帶的高度,設置采樣儀器的進氣口高度保持為1.5~2 m。由于體育場館內污染源較多且相對集中,因此取樣點的確定采用同心圓方式選取。同時根據采樣點布置原則,使采樣器和墻壁保持1 m以上、離門窗在3 m以上,每天24 h連續(xù)采樣,共采樣30 d。采樣前稱取濾膜質量、采樣后再根據濾膜質量差和采樣體積,得出細顆粒物的質量濃度。采樣結束后收集濾膜,然后將濾膜裁剪為小塊后浸入去離子水中,利用超聲振蕩器進行4次震蕩,每次30 min,再用去離子水對顆粒物進行洗脫;將濾液在4 ℃下進行20 min離心,轉速為1 000 r·min-1,最后真空干燥后稱重,-20 ℃保存。染毒前需用0.9%生理鹽水配制成高、中、低3個濃度,使用前超聲振蕩混勻,滅菌后給大鼠進行氣管滴注。

      1.2 儀器與試劑

      BECKMAN AD 340化學發(fā)光酶標儀(美國);MR23i 型低溫高速離心機(美國 Thermo公司);電動跑臺(中國杭州段氏制作公司);Bonso-TCS-2000 A電子稱(武漢自動化儀表廠);DK-98-1A恒溫浴鍋(天津泰斯特有限公司);TN-100托盤扭力天平(武漢自動化儀表廠);TH-150C型大容量大氣總顆粒物智能采樣器(配2.5 μm的切割器)(武漢天虹)。

      1.3 實驗動物分組與運動方案

      選用7周齡雄性健康大鼠32只(由西安交通大學醫(yī)學院動物飼養(yǎng)中心提供),級別為SPF(specific pathogen free,SPF),體重180~220 g。實驗大鼠的飼養(yǎng)及實驗均按照《關于善待實驗動物的指導性意見》進行操作[6]。訓練前將實驗大鼠先進行2 d的適應性跑臺訓練,速度為10 m·min-1、持續(xù)時間為5 min·d-1;正式訓練前再將所有大鼠隨機分為EC、LPE、MPE和HPE組,每組8只,所有實驗大鼠進行1 d的訓練前恢復,1 d后按照15 m·min-1×15 min(相當于45% VO2 max),18 m·min-1×20 min(相當于50% VO2 max),21 m·min-1×30 min(相當于65% VO2 max),24 m·min-1×40 min(相當于70% VO2 max),27 m·min-1×50 min (相當于76% VO2 max)的遞增負荷形式進行,具體訓練方案見下表1。

      表1 大鼠運動方案一覽表(n=8)Table 1 The incremental training model of rats (n=8)

      1.4 實驗動物染毒劑量與染毒方式

      染毒前先將制備好的PM2.5懸液在水浴鍋內預熱到37 ℃,按照30 mg·kg-1、15 mg·kg-1、7.5 mg·kg-1劑量/體重比進行氣管滴注,滴注體積為3 mL·kg-1[7]。為了使PM2.5懸液均勻分布,滴注后立即將大鼠直立并旋轉;EC組按照同樣的劑量和方式滴注同等體積的生理鹽水。

      1.5 組織勻漿制備及指標測試

      血清制備:大鼠運動結束后,腹腔注射麻醉(20%烏拉坦溶液),腹主動脈取血,然后將血液置于37 ℃恒溫水浴5 min 后取出,用高速冷凍離心機按照3 500 r·min-1離心15 min,分離血清并置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

      肺泡灌洗液:大鼠處理同血清制備,取血后即刻處死,然后切開頸部皮膚,暴露氣管,結扎左肺,在主氣管處剪一“V”形小切口,插人灌洗針頭,結扎固定。注射器抽取37 ℃生理鹽水緩慢注入肺內,同時輕輕按摩胸壁,待右肺變得膨隆后緩慢抽出灌洗液。灌洗2次,第1次注入6 mL,第2次注入3 mL,混勻抽吸2次,至灌洗液總量為6 mL。然后以4 000 r·min-1、4oC下離心20 min,取上清液于-20 ℃保存以進行后續(xù)測試。

      股四頭肌勻漿制備:取組織塊(0.5 ~1 g),在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干、稱重,放入5 mL的小燒杯內按W (g):V (mL)=1:9的比例加入預冷的勻漿介質(pH 7.4, 0.01 mol·L-1Tris-HCL,0.0001 mol·L-1EDTA-2Na,0.01 mol·L-1蔗糖, 0.8%的NaCl溶液),冰浴條件下用眼科小剪盡快剪碎組織,然后倒入研缽中按順時針方向進行研磨至糊狀。勻漿液通過二層紗布過濾,低溫冷凍離心機4 000 r·min-1離心10 min,將分離的上清液4 ℃保存。

      指標測試:酶聯(lián)免疫吸附實驗測試HK、PK、PFK-1。

      卒中指數評分[8]:總分25分,0~3分為癥狀組,3~9分為中間組,可能有損傷,10分明顯有損傷。毛發(fā)臟亂顫抖:1分,運動減少或遲鈍:1分,耳觸覺遲鈍:1分,頭翹起:3分,眼固定狀睜開:3分,后肢外展呈“八”字:3分,上瞼下垂:1分,轉圈:3分,驚厥或爆發(fā)運動:3分,極度衰弱:6分。

      神經病學癥狀評分[8]:總分10分,0分正常,1~3分輕度損傷,4~6分中度損傷,7~l0分嚴重損傷。有自發(fā)探究:0分。刺激時能走動:1分,正常步態(tài):0分,共濟失調:1分,爬行:2分,無步態(tài):3分。能進食:0分,不能進食:1分,能飲水:0分,不能飲水:1分,疼痛刺激可移動:0分,僅頭或軀干運動:1分,肢體回縮或無反應:2分。

      1.6 統(tǒng)計學分析

      2 結果(Results)

      2.1 PM2.5暴露對運動大鼠行為學的影響

      染毒后各組大鼠卒中得分和神經病學癥狀評分結果見表2。數據顯示,與EC相比,LPE、MPE和HPE組大鼠的卒中得分和神經病學癥狀評分隨著暴露濃度的增加而升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

      表2 PM2.5暴露對運動大鼠行為學的影響(n=8)Table 2 Effects of PM2.5 exposure on behavior in exercise rats (n=8)

      注:EC、LPE、MPE和HPE是運動對照組、低劑量運動組、中劑量運動組、高劑量運動組;與對照組相比,**P<0.01。

      Note: EC, LPE, MPE and HPE stand for control group, low dose PM2.5+excercise, medium dose PM2.5+excercise, high dose PM2.5+excercise; compared with EC,**P<0.01.

      2.2 PM2.5暴露對大鼠血清無氧代謝酶的影響

      染毒后各組大鼠血清無氧代謝酶活性的變化見表3。由表3可知,和EC組相比,LPE、MPE、HPE組HK、PK、PFK-1酶活性均下降且成劑量相關反應,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

      2.3 PM2.5暴露對大鼠BALF無氧代謝酶的影響

      染毒后各組大鼠BALF無氧代謝酶活性的變化見表4。由表中數據看出,和EC組相比,3個劑量組HK、PK、PFK-1酶活性下降且與PM2.5濃度成劑量相關性反應,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。

      2.4 運動及PM2.5暴露對大鼠股四頭肌無氧代謝酶的影響

      染毒后各組大鼠股四頭肌無氧代謝酶的影響見表5。表5數據顯示,和EC組相比,HK、PK、PFK-1酶活性隨著PM2.5濃度的增大而呈劑量相關性下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。

      3 分析與討論(Analysis and discussion)

      3.1 PM2.5暴露對運動大鼠行為學的影響

      運動行為學是運用相關運動學科的理論來研究運動訓練的過程,在認識、情感、動機、環(huán)境因素影響下的行為特征及規(guī)律性。大鼠對外界的應激反應是一個復雜的過程,為了保持體內穩(wěn)態(tài)的平衡和維持一定的生理機能,機體在做出反應的過程中,必然會通過各種生理生化指標的變化來進行調節(jié),而這種機體對應激的調節(jié)與施加的運動類型、運動方式、運動強度、暴露方式和暴露濃度有關。在行為學的評價中,運動學習、運動發(fā)展和運動控制3個環(huán)節(jié)是3個主要的指標[9],而不同指標反映不同的功能。卒中指數主要反映腦組織損傷的程度,而“神經病學癥狀評分”綜合反映了肌肉前庭運動功能、綜合平衡能力,它與“卒中指數評分”的相關性較高,二者都是行為學評價常用的方法。

      表3 PM2.5暴露對大鼠血清無氧代謝酶的影響(n=8)Table 3 The activities of anaerobic metabolism enzyme in serum of training rats after PM2.5 exposure (n=8)

      注:與對照組相比,**P<0.01。

      Note: compared with EC,**P<0.01.

      表4 PM2.5暴露對大鼠BALF無氧代謝酶的影響(n=8)Table 4 The activities of anaerobic metabolism enzyme in BALF of training rats after PM2.5 exposure (n=8)

      注:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。

      Note: compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

      表5 PM2.5暴露對大鼠股四頭肌無氧代謝酶的影響(n=8)Table 5 The activities of anaerobic metabolism enzyme in quadriceps of training rats after PM2.5 exposure (n=8)

      注:與對照組相比,*P<0.05,**P<0.01。

      Note: compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

      實驗數據結果顯示,和運動對照組比較,大鼠的卒中指數和神經病學癥狀評分隨著PM2.5暴露濃度的增加而上升,在高濃度組分值已超過12分,且差異具有統(tǒng)計學意義,根據評分標準屬于“明顯有損傷”類別。結合卒中和神經病學癥狀評分標準,主要體現(xiàn)在自主性運動速度降低、運動行為遲鈍、高濃度組的部分大鼠在運動過程中出現(xiàn)毛發(fā)臟亂無光澤、間歇性顫抖、逃避運動,在運動后期個別出現(xiàn)衰弱癥狀,需器械輔助才能進行運動。本實驗的結果表明,運動強度和PM2.5暴露濃度是影響大鼠運動能力的2個重要因素,尤其是高濃度的PM2.5暴露會造成大鼠的運動行為功能減弱[10],其機制是PM2.5進入血液循環(huán)以后,影響到機體的內穩(wěn)態(tài)平衡,從而導致包含神經系統(tǒng)在內的功能受到抑制,同時觸發(fā)或者加劇破壞了氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡[11]。另外,運動時能量的供應需要離子的轉運,而卒中的發(fā)生伴有細胞內外信息傳遞的一系列不穩(wěn)定性變化[12],Ca2+超載是導致細胞損傷甚至凋亡的機制之一,在運動醫(yī)學界,認為運動疲勞和恢復與鈣穩(wěn)態(tài)和鈣超載也有密切的關聯(lián)[13]。另外,從運動過程中大鼠的行為表現(xiàn)來推測,PM2.5暴露是否會造成運動情緒低落從而導致卒中指數升高還需進一步探討,但是這種PM2.5暴露濃度的變化,可以理解為是大鼠運動行為和大腦組織病理學改變之間的一種表現(xiàn)形式。

      室內空氣污染對神經系統(tǒng)的損傷是顆粒物常見的毒性效應表現(xiàn)之一,這主要與氧化與抗氧化系統(tǒng)的失衡有關[14]。本實驗中神經病學評分表現(xiàn)在染毒組高于運動組,也呈一定的劑量反應關系,由于“神經病學癥狀評分”與機體的前庭運動功能密切相關,因此在高劑量PM2.5組大鼠出現(xiàn)共濟失調和肢體回縮或無反應癥狀。其他研究也發(fā)現(xiàn),運動大鼠在水平運動、垂直運動后活動能力水平和活動興趣均下降[15],這說明了PM2.5暴露會對大鼠的行為學功能產生不良的影響。其機制是大鼠在PM2.5暴露和運動的雙重刺激下,氧化損傷可能引起神經遞質的異常產生與釋放,導致神經興奮或抑制性毒性作用[16],由于機體的反應不足以平衡這種應激水平,因此其神經內分泌、學習記憶、免疫調節(jié)網絡、行為能力等均會受到明顯的影響[17]。產生的主要中樞效應為:抑郁、焦慮等情緒行為改變,并且在應激反應中HPA軸起到了將神經信息轉換成生理反應的模式[18],從而影響到大鼠的行為學方面的功能,并進一步造成運動行為的反應遲緩。因此,PM2.5暴露對運動大鼠行為學的影響,歸根結底是顆粒物毒性導致大腦神經系統(tǒng)氧化損傷,誘導學習記憶功能障礙[19],這些神經指標的異常表達和神經系統(tǒng)的功能異常反應到行為學上,表現(xiàn)為學習記憶和運動能力降低。

      3.2 PM2.5對運動大鼠血清、BALF和股四頭肌的HK、PK、PFK-1的影響

      正常生理條件下,機體的運動離不開能量的供應,而人體內的各種能量代謝受到嚴格而精確的調節(jié),以滿足機體的需要。這種調節(jié)主要是通過代謝過程中的限速酶來平衡反應速度,不同的外界應激會引起相關酶發(fā)生適應性變化,使運動與能量代謝具有楔合性特征。

      PM2.5暴露對呼吸系統(tǒng)的損傷存在連續(xù)性或慣性效應[20],環(huán)境因子、運動強度和持續(xù)時間都是影響血清酶活性的重要因素。PM2.5對肺功能的影響存在一定滯后性,并和暴露時間的長短之間存在短期或長期負效應[21]。

      HK、PK、PFK-1作為糖無氧代謝的限速酶,其活性很容易受到外界因素的干擾,造成整個代謝體系受影響。實驗中表3、4、5數據顯示,PM2.5染毒后HK、PK、PFK-1 3種酶活性隨著暴露濃度的增高而降低,表明PM2.5暴露會影響機體的糖無氧代謝速率,從而限制機體的無氧供能能力。血清中3種酶活性的降低主要是因為:(1) PM2.5進入機體后可以使細胞膜受損,增加膜的通透性,降低膜對流通物質分子的選擇能力[22-23]。(2) PM2.5所攜帶的有機污染物和重金屬可以誘導機體產生自由基;結合本實驗中卒中指數和神經病學癥狀評分的結果分析,PM2.5在使抗氧化系統(tǒng)平衡得到破壞之時,同時誘導神經系統(tǒng)興奮或抑制的失衡,導致神經遞質產生和釋放異常,使神經系統(tǒng)對機體行為的控制受到不良的影響,而組織內酶的合成和分解代謝與神經遞質酶基因表達有關[24]。缺氧時神經傳遞遞質降低引起動物行為改變,說明中樞神經遞質合成及代謝改變是引起缺氧時腦功能障礙的重要因素。另外,自由基和酶發(fā)生環(huán)氧化反應的過程中,使糖代謝底物發(fā)生變構從而影響與酶的楔合效應,其最終結果是減少代謝酶的生成量[25]。

      流行病學研究發(fā)現(xiàn),PM2.5與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率密切相關[26],BALF中生化指標的變化也是肺損傷的表現(xiàn)。本實驗中BALF中各種限速酶的活性變化,顯示出了肺對PM2.5暴露濃度的敏感性和脆弱性。其機制可能是PM2.5破壞了肺泡上皮-毛細血管屏障,使酶從胞漿中滲出,導致肺實質和膜性組織的損傷[27]。另外,自由基與PM2.5的毒性累加效應,可以競爭性抑制酶和底物的結合,導致酶活性的降低。

      HK、PK、PFK-1活性的大小是反映組織能量狀態(tài)的重要指標。股四頭肌在運動過程中對能量供應系統(tǒng)調動的過程,實際上就是激活限速酶的過程。本實驗中HK、PK、PFK-1 3種酶在PM2.5暴露后均有下降趨勢,表明PM2.5降低了運動大鼠的糖酵解系統(tǒng)的供能能力。這是因為PM2.5所吸附的有害物質,不僅可以直接造成組織細胞損傷,而且某些金屬原子還可能與線粒體膜上Ca2+競爭結合,干擾細胞信號的傳遞,從而引起線粒體細胞膜內鈣穩(wěn)態(tài)失調[28],危及線粒體功能和細胞骨架結構,最終激活不可逆的細胞內成分的分解代謝過程。

      本實驗數據顯示HK、PK、PFK-1活性的降低與PM2.5濃度具有明顯的負相關。結合實驗中大鼠行為學的數據表明,PM2.5濃度越高,對機體運動能力的影響越大。因此,我們通過本實驗研究低、中、高3種不同濃度的PM2.5滴注對運動環(huán)境下機體行為學及代謝酶的影響,也是為分析人群在不同的PM2.5暴露水平-暴露時間-運動方式-運動場所-運動對象之間的關系提供一定的數據支持。同時,也為進一步闡明在PM2.5暴露的污染環(huán)境下運動對人體健康傷害的機制提供參考。

      總之,通過本實驗結果我們得出:(1) 3種濃度的PM2.5暴露可以影響大鼠的運動行為學表現(xiàn),降低大鼠的運動能力;(2) PM2.5染毒后HK、PK、PFK-1活性均下降,影響機體糖代謝能量的供給。

      通訊作者簡介:李峰(1982—),男,環(huán)境科學(健康生態(tài)學)博士,副教授,主要研究方向為空氣質量與運動健康之間的關系研究。

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