秋水仙素誘導(dǎo)馬鈴薯野生種S.acaule多倍體的初步研究

張艷萍 蒲秀琴

（青海省農(nóng)林科學(xué)院/教育部青藏高原生物技術(shù)重點實驗室，西寧 810016）

種質(zhì)資源是作物遺傳改良的基礎(chǔ)，馬鈴薯在其起源中心有著豐富的野生種和馬鈴薯原始栽培種，是改良現(xiàn)有品種的寶貴資源。馬鈴薯野生種因其長期生長在野外，對不良環(huán)境具有較強的適應(yīng)能力和抵御能力，含有多種逆境抗性基因，具有優(yōu)良的抗病蟲害能力，對病毒病有較高抗性甚或免疫[1]；許多野生種具有普通栽培種缺乏的優(yōu)良品質(zhì)性狀[2-4]。野生馬鈴薯特異性狀的發(fā)掘和研究，對于從中獲得優(yōu)良品質(zhì)性狀和抗性基因，持續(xù)改良現(xiàn)有栽培種具有十分重要的意義。

馬鈴薯野生種因大部分為二倍體種而很難與為四倍體的普通栽培種進行雜交，要解決這一障礙，一種方法是誘導(dǎo)普通栽培種產(chǎn)生雙單倍體，另一種方法是通過人工誘導(dǎo)而使野生種染色體加倍，從而可以與普通栽培種進行雜交。利用秋水仙素加倍馬鈴薯染色體的方法，常用的是幼芽液滴涂抹法[5]，而建立在完整的植物再生體系基礎(chǔ)上的離體誘導(dǎo)具有誘導(dǎo)環(huán)境更容易控制，試驗結(jié)果易于重復(fù)的優(yōu)勢，而且試驗所得到的多倍體植株更易于篩選和保存。雷家軍等[6]用不同濃度的秋水仙素處理組培苗的莖尖，建立了草莓莖尖加倍的技術(shù)體系；楊麗娟等[7]在離體培養(yǎng)條件下，以大花蕙蘭原球莖為材料，利用秋水仙素誘導(dǎo)大花蕙蘭產(chǎn)生多倍體。

馬鈴薯野生種S.acaule（無莖薯）是改良馬鈴薯耐凍性的重要基因資源[8]，原產(chǎn)于南美，為四倍體種，但其胚乳平衡數(shù)為2，只能與二倍體種雜交，與栽培種雜交時必須先將染色體加倍。本試驗以馬鈴薯野生種S.acaule無菌苗帶腋芽莖段為誘導(dǎo)材料，就秋水仙素誘導(dǎo)濃度及處理時間對多倍體誘導(dǎo)結(jié)果加以分析，以期建立秋水仙素誘導(dǎo)馬鈴薯莖段染色體加倍的離體誘導(dǎo)體系，為野生馬鈴薯資源的充分利用創(chuàng)造條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 馬鈴薯野生種S.acaule擴繁20d后幼苗帶腋芽莖段，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為馬鈴薯莖段扦插擴繁培養(yǎng)基，光照強度2000Lx，光照時長16h/d，溫度 20～25℃。

1.2 試驗方法

1.2.1 浸泡法 將野生種S.acaule帶腋芽莖段轉(zhuǎn)移到已滅菌處理，濃度分別為0.1%、0.3%和0.5%的秋水仙素溶液中，浸泡12h、24h和36h，以無菌水為對照，共10個處理，每個處理20株，3次重復(fù)。處理后用無菌水清洗，接種到擴繁培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)。20d后觀察莖段生根成苗情況，統(tǒng)計存活率；待根長約1.5cm時取根尖進行倍性鑒定，計算變異率。

1.2.2 混合培養(yǎng)法 將野生種S.acaule帶腋芽莖段轉(zhuǎn)接到分別添加了0.1%、0.3%和0.5%的秋水仙素溶液的繼代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d、14d和21d，以普通繼代培養(yǎng)基為對照，共10個處理，每個處理20株，3次重復(fù)。處理后轉(zhuǎn)入普通繼代培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。20d后觀察莖段生根成苗情況，統(tǒng)計存活率；待根長約1.5cm時取根尖進行倍性鑒定，計算變異率。

1.2.3 染色體倍性鑒定 采用根尖細胞染色鏡檢的方法，剪取誘導(dǎo)生成的組培苗幼嫩根尖0.3～0.5cm，用0.002mol/L的8-羥基喹啉預(yù)處理3h；將預(yù)處理后的材料用清水洗2遍，然后放入卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中，4℃下固定24h；棄去固定液，將根尖置于60℃恒溫水浴中，用1mol/L鹽酸酸解10min，然后用蒸餾水洗3次；制片前用45%醋酸軟化根尖1min左右，用改良碳酸品紅染色5min后進行壓片，鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素濃度及處理時間對馬鈴薯野生種莖段多倍體誘導(dǎo)的影響

2.1.1 浸泡法 從表1可以看出，誘導(dǎo)莖段在不同濃度秋水仙素溶液中浸泡規(guī)定時間后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，都有一定比例莖段發(fā)根成苗。隨著秋水仙素濃度的增加和處理時間的延長，存活率呈降低趨勢，但變異率呈先增大后減小趨勢。在秋水仙素濃度為0.3%、浸泡36h時莖段的變異率最高，為15.0%；在秋水仙素濃度為0.1%時，浸泡12h與24h變異率均為0。

表1 秋水仙素溶液浸泡對莖段誘導(dǎo)加倍的效果

經(jīng)秋水仙素浸泡的帶腋芽莖段在轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基后生長較對照緩慢，大約15d后才開始生根，浸泡濃度越高，生長越緩慢?？梢姡锼伤貙ηo段存在一定的毒害作用，且濃度越高、處理時間越長毒害作用越大，對腋芽的發(fā)根成苗具有一定的抑制作用。

2.1.2 混合培養(yǎng)法 從表2可看出，在繼代培養(yǎng)基中添加不同濃度的秋水仙素溶液共同培養(yǎng)，隨著秋水仙素濃度的增加和共同培養(yǎng)時間的延長，存活率呈下降趨勢；但變異率呈現(xiàn)先增大后減小趨勢，并在秋水仙素濃度為0.3%、共培養(yǎng)時間為14d時變異率最大為31.6%。當秋水仙素濃度為0.5%時，隨著培養(yǎng)時間的延長，存活率明顯降低，變異率也在降低。由此可見，要想獲得較高的變異率必須是適宜的秋水仙素濃度與處理時間結(jié)合起來。

表2 秋水仙素溶液混合培養(yǎng)對莖段誘導(dǎo)加倍的效果

混合培養(yǎng)法中莖段處理后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基成苗存活率較浸泡法低，表明在繼代培養(yǎng)基中添加秋水仙素共同培養(yǎng)對莖段的毒害作用較浸泡法大，但變異率較浸泡法的高。

2.2 多倍體鑒定 形態(tài)鑒定初步篩選組培苗葉片變厚、莖變粗、節(jié)間變短的植株為變異株，單株切取帶腋芽莖段轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基25d后進行染色體鑒定，分別切取四倍體野生種S.acaule和形態(tài)鑒定為變異株的根尖2～3mm進行染色體制片，并在熒光顯微鏡下鏡檢。觀察顯示，四倍體的染色體數(shù)目為2n=4x=48，變異株染色體觀察中發(fā)現(xiàn)，大部分變異株為嵌合體，即細胞中既有四倍體細胞，也有六倍體細胞，還有八倍體細胞，87株變異株通過鏡檢獲得2株八倍體植株。

3 結(jié)論與討論

秋水仙素的作用是抑制細胞分裂中期紡錘絲的合成，染色體雖然縱裂，但細胞不分裂，不能形成2個子細胞，因而使染色體加倍。自1937年A.F.Blakeslee等人利用秋水仙素處理曼陀羅獲得多倍體后，秋水仙素就被公認為是最好的誘導(dǎo)植物多倍體的化學(xué)藥劑[9]，廣泛應(yīng)用于細胞學(xué)、遺傳學(xué)和植物育種的工作。但秋水仙素對外植體的毒害作用大，并與處理濃度和處理時間成正比，過高的濃度反而會降低誘導(dǎo)變異率。在試驗中獲得的變異植株在繼代增殖過程中也有白化死亡現(xiàn)象發(fā)生。

本試驗中以馬鈴薯野生種S.acaule無菌苗帶腋芽莖段為誘導(dǎo)材料，采用秋水仙素溶液浸泡法和混合培養(yǎng)法2種處理方式均可獲得倍性變異植株，同一濃度時，混合培養(yǎng)法較浸泡法能獲得較高的變異率。在誘導(dǎo)材料和誘導(dǎo)方法確定時，篩選秋水仙素溶液最適誘導(dǎo)濃度和處理時間的組合是獲得高變異率的關(guān)鍵。試驗結(jié)果表明在繼代增殖培養(yǎng)基中添加濃度為0.3%的秋水仙素，共同培養(yǎng)時間為14d時獲得誘導(dǎo)變異率最大為31.6%。

嵌合體是秋水仙素誘導(dǎo)多倍體研究中普遍發(fā)生的現(xiàn)象，不經(jīng)分離穩(wěn)定會產(chǎn)生回復(fù)突變，如何有效地篩選及分離嵌合體還需進一步開展研究。馬鈴薯同源多倍體的開花結(jié)實性狀也有待進一步探討。

[1] Vallejo R L，Collins W W，Schiavone R D，et al．Extreme resistance to infection by potato virus Y and potato virus X in an advanced hybrid Solanum phureja—S．Stenotomum diploid potato population[J]．Am Potato J，1994，71（10）：617-628

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[4] 金黎平．二倍體馬鈴薯加工品質(zhì)及重要農(nóng)藝性狀的遺傳分析[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2006

[5] 孫慧生．馬鈴薯育種學(xué)[M]．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003

[6] 雷家軍，吳祿平，代漢萍，等．草莓莖尖染色體加倍研究[J]．園藝學(xué)報，1999，26（1）：13-18

[7] 楊麗娟，高素萍，鄒宗蘭．秋水仙素離體誘導(dǎo)大花蕙蘭多倍體試驗[J]．中國種業(yè)，2009（6）：51-53

[8] 李飛．野生馬鈴薯植株苗期耐凍性鑒定及耐凍機理研究[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008

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