周佳琦 王小嬌 陸亞媛 胡琦蘭 陳西敬 陳丁丁

肺部給藥作為一種非侵入性的給藥方式日益受到醫(yī)藥界的重視, 無論其用于局部用藥還是全身治療。近年來, 殼聚糖(chitosan, CS)在肺部給藥領域被廣泛地研究, 應用于各種劑型 , 如 CS 包裹的脂質體［1］、納米粒［2］以及干粉吸入劑［3,4］。但是, CS僅在酸性條件下溶解, 不適合在中性條件下包載藥物, 這限制了其應用［5］。因此, 許多科研工作者將興趣轉向CS的衍生物或將CS進行結構改造, 以期獲得更好的理化性質、提高其生物降解性能、減低毒性［6］。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan, CMCS)是一種水溶性的CS衍生物,在較寬的pH范圍內呈現較好的溶解性［7］。研究表明, CMCS有著與CS相似的性質, 如低毒性、生物相容性和生物可降解性［8］。目前, CMCS修飾的納米?；蛑|體在遞送抗癌藥物、蛋白質藥物、基因和抗體藥物等方面均被深入研究［9］。但是, 到目前為止, 還沒有將CMCS修飾的納米制劑應用于肺部給藥的研究。本研究選擇一種治療非小細胞肺癌的小分子藥物吉非替尼(Gefitinib, GEF)作為模型藥, 制備普通GEF脂質體(GEF-LPs)、取代度為0.6的CMCS修飾的GEF脂質體(0.6 CMCS-GEF-LPs)以及取代度為0.9的CMCS修飾的GEF脂質體(0.9 CMCS-GEF-LPs), 考察這三種脂質體通過肺部給藥后, 吉非替尼在肺部、肺泡灌洗液以及血漿中的分布情況,為CMCS進一步應用于肺部給藥提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 吉非替尼, 厄洛替尼(大連美侖生物技術有限公司)；羧甲基殼聚糖(青島云宙生物科技有限公司)；大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司)；膽固醇(百靈威科技有限公司)；二氯甲烷, 乙酸乙酯(南京化學試劑有限公司)；乙腈(美國Tedia天地試劑有限公司)。

1.2 儀器 TSQ Quantum Access三重四極桿串聯質譜儀,配備電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur 2.0.7數據處理系統(tǒng)(美國Thermo Scientific公司)；島津LC-20AD液相色譜系統(tǒng)；激光散射粒徑分析儀(Brookhaven, 美國)；探頭超聲細胞破碎儀(Sonics公司)；旋轉離心濃縮儀(上海愛郎儀器有限公司, 型號EYELAN-1100)；高速冷凍離心機(Eppendorf型號5430-R)。

1.3 動物 SD大鼠, 體重180～220 g, 由上海杰思捷實驗動物有限公司提供, 實驗動物許可證號：SYXK(滬)2013-0006。

1.4 方法

1.4.1 普通吉非替尼脂質體的制備 本實驗采用薄膜分散法制備吉非替尼脂質體。稱取100 mg大豆磷脂、10 mg 膽固醇以及2.5 mg 藥物, 用20 ml二氯甲烷溶解后置于圓底燒瓶中。減壓蒸干有機溶劑至在燒瓶底部形成一層薄膜。加入8 ml去離子水水合, 間歇超聲(超聲1 s, 停2 s)3 min得到均勻脂質體混懸液。用0.22 μm微孔濾膜過濾, 即得到普通吉非替尼脂質體。

1.4.2 CMCS修飾的吉非替尼脂質體的制備 稱取適量的CMCS, 加去離子水溶解, 使其形成濃度為0.2%(W/V)的CMCS水溶液。向上述制得的普通脂質體中分別滴加入等體積不同取代度的兩種CMCS溶液, 室溫下磁力攪拌30 min,即得CMCS修飾的吉非替尼脂質體。

1.4.3 粒徑、分散系數、電位的測定 分別取制備好的3種脂質體, 加去離子水稀釋后, 用激光散射粒徑分析儀測定平均粒徑以及多分散系數(PDI)。另取稀釋后的脂質體, 用Zeta電位分析儀測定表面電位。

1.4.4 包封率的測定 取脂質體混懸液, 用乙腈破乳、稀釋后測定GEF的濃度, 得到藥物的總含量；另取脂質體適量,以5000 r/min離心5 min除去游離的GEF［10］, 取上層脂質體,同上法破乳稀釋后測定濃度, 得到包裹在脂質體中藥物的含量。GEF的含量用“1.4.6 樣品測定方法”所述的LC-MS/MS方法測定。包封率=包裹在脂質體中藥量/總藥量×100%。

1.4.5 大鼠組織分布試驗 取27只SD大鼠, 隨機分成3組,每組9只, 分別通過肺部給予GEF-LPs、0.6CMCS-GEF-LPs和0.9CMCS-GEF-LPs。劑量均為0.7 mg/kg。肺部給藥方法為注射器氣管滴注。3組分別于給藥后0.5、1、3 h將3只大鼠股動脈放血處死, 收集血漿、肺泡灌洗液以及肺組織。

肺組織樣品處理：取組織稱重、剪碎, 加入生理鹽水制成勻漿液。在1.5 ml離心管中加入厄洛替尼(內標)50 μl, 揮干溶劑。再將樣品50 μl加入到離心管中, 渦旋混勻。加入萃取試劑(乙酸乙酯)400 μl, 渦旋混勻5 min, 15000 r/min離心5 min。取上清300 μl至另一套離心管中, 揮干溶劑, 殘渣用乙腈100 μl復溶后用于LC-MS/MS分析。

1.4.6 樣品測定方法 本試驗通過LC-MS/MS法測定GEF的濃度。液相條件：色譜柱：島津BDS Hypersil C18色譜柱(50 mm×2.1 mm, 5μm)；流動相：乙腈 -5 mM乙酸銨 (70∶30)；流速：0.35 ml/min；柱溫：40℃；進樣體積：10 μl。質譜條件：離子源溫度：400℃；噴霧電壓：4.5 kV；加熱毛細管溫度：400℃；鞘氣壓力：35 Arb；輔助氣壓力：25 Arb；碰撞氣壓力：1.5 mTorr；正離子方式檢測；掃描模式：多反應檢測模式(MRM)。用于定量分析的離子：447.0 → 128.0 m/z(GEF)和395.0 →278.7 m/z(厄洛替尼)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 吉非替尼脂質體的理化性質 本試驗制備的吉非替尼脂質體的包封率較高, 用濃度為0.2%的兩種取代度的CMCS包覆GEF脂質體后, 包封率略微降低, 脂質體的粒徑、PDI略有增大。由于CMCS在生理pH下帶負電［5］, CMCS使原本帶正電的普通脂質體轉變?yōu)閹ж撾?。制備得到的三種脂質體均具有較高的包封率, 適中的粒徑和分散系數, 且Zeta電位較高, 說明體系較為穩(wěn)定。脂質體包封率、粒徑、PDI、Zeta電位的結果。見表1。

表1 不同取代度的CMCS包覆GEF脂質體包封率、粒徑、PDI、Zeta電位比較

表1 不同取代度的CMCS包覆GEF脂質體包封率、粒徑、PDI、Zeta電位比較

三種脂質體 EE (%) Size (nm) PDI Zeta-Potential (mV)GEF-LPs 94.0±1.23 131.2±3.1 0.168 +27.81±2.1 0.6CMCS-GEF-LPs 90.6±0.68 155.7±4.3 0.245 -28.38±3.2 0.9CMCS-GEF-LPs 91.8±1.85 149.7±2.9 0.211 -27.40±3.5

2.2 不同組織分布結果 在0.5 h時, 兩種CMCS修飾的脂質體在肺部和肺泡灌洗液中的濃度明顯低于普通脂質體組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在1 h和3 h時, 3種脂質體在肺部、血漿、肺泡灌洗液中藥物分布比較, 差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。CMCS能夠明顯增加脂質體在肺部吸收的速度和程度, 但CMCS的取代度對脂質體在肺部的吸收沒有顯著的影響。GEF隨時間在肺部、血漿、肺泡灌洗液中的分布。見表1、圖1。

表1 大鼠肺部給予三種脂質體后在不同檢測標本中的吉非替尼比較

表1 大鼠肺部給予三種脂質體后在不同檢測標本中的吉非替尼比較

注：與GEF-LPs比較，aP<0.05

檢測標本 時間(h) GEF-LPs(n=3) 0.6CMCS-GEF-LPs(n=3)0.9CMCS-GEF-LPs(n=3)肺組織(ng/g) 0.5 5655.87±297.52 3213.67±84.38a 3055.88±165.77a 1 2051.52±235.95 1667.23±36.09 1986.55±46.78 3 587.50±77.34 659.59±113.00 846.42±131.50血漿(ng/ml) 0.5 99.21±9.63 185.76±15.09a 181.96±27.10a 1 103.88±5.32 101.95±6.51 100.52±6.77 3 39.29±2.32 44.28±1.07 37.33±0.61肺泡灌洗液(ng) 0.5 1126.80±173.44 453.22±130.31a 428.98±68.00a 1 273.67±40.14 203.25±124.85 179.33±75.43 3 41.57±13.68 76.63±56.85 56.22±23.96

圖1 吉非替尼在三種脂質體經肺給藥后的肺動力學和組織分布

3 討論

CMCS被廣泛應用于藥物載體, 既可以制成凝膠單獨作為藥物載體, 又可以修飾其他載體材料(如脂質體), 以滿足不同理化性質不同給藥途徑藥物的給藥需要［5］。但是目前對CMCS的研究主要集中在其對被修飾藥物載體的穩(wěn)定性、pH敏感性、緩釋作用等的影響上, 尚未有研究者考察CMCS對于藥物肺部給藥的影響, 本文為CMCS在肺吸入制劑方面的研究提供參考。

在研究前期, 通過單因素考察和正交實驗確定了吉非替尼脂質體的處方配比和工藝條件, 使脂質體具有較高的包封率和適合的粒徑。同時通過預實驗確定以0.2% CMCS(W/V)來修飾脂質體, 此濃度對于脂質體的包封率影響小。

組織研究結果說明CMCS有助于脂質體透過肺泡壁進入毛細血管, 提高肺部給藥藥物的生物利用度。根據在殼聚糖上羧甲基取代的程度, 將其分為不同取代度的CMCS。徐云龍等［10］發(fā)現羧甲基殼聚糖的羧甲基取代度對于脂質體pH敏感性有一定程度的影響。但是, 羧甲基取代度對于吉非替尼脂質體在肺部的吸收沒有顯著影響(P＞0.05)。

CS目前作為肺部給藥的藥物載體已被廣泛研究, 而對于它的水溶性衍生物CMCS的研究在此方面還是空白。本文的研究結果說明CMCS能夠明顯增加脂質體在肺部吸收的速度和程度, 因此將CMCS應用于肺吸入制劑可能具有一定前景。將CMCS單獨作為載體或與其他藥物載體合用在肺部遞送藥物是否也會改變藥物在肺部的吸收特性尚需要更多的研究。

［1］ Zaru M, Manca ML, Fadda AM, et al.chitosan-coated liposomes for delivery to lungs by nebulization.Colloids Surf B Biointerfaces,2009, 71(1):88-95.

［2］ Guo X, Zhang X, Ye L, et al.Inhalable microspheres embedding chitosan-coated PLGA nanoparticles for 2-methoxyestradiol.J Drug Target, 2014, 22(5):421-427.

［3］ Learoyd TP, Burrows JL, French E, et al.Modified release of beclometasonedipropionate from chitosan-based spray-dried respirable powders.Powder Technology, 2008, 187(3):231-238.

［4］ Kamble MS.Formulation &characterisation of chitosan based microspheres of salbutamol sulphate dry powder inhaler formulation.J Drug Delivery Ther, 2012, 2(5):37-41.

［5］ 劉鳳喜, 張娜.羧甲基殼聚糖作為藥物載體的研究進展.中國藥學雜志, 2012, 47(10):804-807.

［6］ Islam N, Ferro V.Recent advances in chitosan-based nanoparticulate pulmonary drug delivery.Nanoscale, 2016, 8(30):14341-14358.

［6］ Wang Q, Lv S, Lu J, et al.Characterization, stability and in vitro release evaluation of carboxymethyl chitosan coated liposomes containing fish oil.J Food Sci, 2015, 80(7):C1460-1467.

［7］ Shi X, Du Y, Yang J, et al.Effect of degree of substitution and molecular weight of carboxymethyl chitosan nanoparticles on doxorubicin delivery.Journal of Applied Polymer Science, 2006,100(6):4689-4696.

［8］ Bai X, Kong M, Xia G, et al.Systematic investigation of fabrication conditions of nanocarrier based on carboxymethyl chitosan for sustained release of insulin.Int J BiolMacromol, 2017, 102: 468-474.

［9］ Chitkara D, Singh S, Kumar V, et al.Micellar delivery of cyclopamine and gefitinib for treating pancreatic cancer.Mol Pharm,2012, 9(8):2350-2357.

［10］ 徐云龍, 姜厚友, 錢秀珍, 等.羧甲基殼聚糖修飾阿霉素納米脂質體的pH敏感性研究.中國藥科大學學報, 2008, 39(3):209-213.