范艷敏 黨士坤 王文杰 王慧梅

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

木豆(Cajanuscajan(Linn.) Millsp.)為豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionaceae)木豆屬(Cajanus)植物，具有廣泛的食用及藥用價值。已有研究表明，黃酮類化合物(Flavonoids)及芪類化合物(Stilbenes)為木豆的主要藥用活性成分，其中具有2-苯基色原酮(flavone)結(jié)構(gòu)化合物的黃酮類化合物是一類存在于自然界的一類低分子天然植物成分，具有降血壓、抗炎、抗過敏、解痙、利尿的作用，此外，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗感染、抗氧化和清除自由基等作用。次生代謝產(chǎn)物染料木素、芹菜素、牡荊苷、異牡荊苷及葒草苷是木豆根中主要的黃酮類化合物，其中染料木素為異黃酮結(jié)構(gòu)化合物，芹菜素為黃酮結(jié)構(gòu)化合物，因兩者均具有很強(qiáng)的藥理活性，附加值高、市場需求大，故成為藥品、保健品和食品添加劑的重要原料[1～4]。

許多物種的不定根培養(yǎng)具有穩(wěn)定合成次生代謝物質(zhì)的能力[5～6]。由于遺傳和生物合成的穩(wěn)定性，利用不定根培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物非常具有吸引力[5]。近年來，國內(nèi)外通過培養(yǎng)不定根生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物的研究日益活躍，此技術(shù)已在人參等多種藥用植物中得以成功應(yīng)用[7～10]。不定根的生長及次生代謝產(chǎn)物的合成受許多理化因子的影響[11～12]。培養(yǎng)基的初始蔗糖濃度對不定根的生長有很大的影響，蔗糖的濃度過低或過高都不利于不定根的生長，而且蔗糖濃度對不定根的次生代謝產(chǎn)物合成也有重要影響[13～14]。植物生長素對不定根的誘導(dǎo)及增殖起著關(guān)鍵的作用[15]，IBA對大多數(shù)植物的不定根誘導(dǎo)和生長有很好的效果[5]。通過植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時，往往添加誘導(dǎo)子來改變細(xì)胞的代謝途徑和代謝強(qiáng)度，從而提高植物組織培養(yǎng)中有用次生代謝產(chǎn)物的積累，近年來被得到了廣泛地應(yīng)用[16～17]。

迄今為止，尚未有關(guān)于木豆不定根培養(yǎng)的相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)以木豆無菌苗的不定根為實(shí)驗(yàn)材料，初步研究不同理化因子對木豆不定根生物量和次生代謝產(chǎn)物合成的影響，為木豆不定根的大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 研究材料與方法

1.1 研究材料

木豆不定根的獲得：剪取苗齡15 d左右的木豆無菌苗的不定根，培養(yǎng)在1/2MS+20 g·L-1蔗糖的液體培養(yǎng)基(pH=5.8)中，培養(yǎng)10 d后，收集不定根，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1不同蔗糖濃度對木豆不定根生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

剪取木豆不定根鮮重0.5 g，接種于100 mL分別添加了10、20、30、40 g·L-1蔗糖的1/2MS液體培養(yǎng)基中，3次重復(fù)，于第25 d時收集樣品測定木豆不定根的鮮重、干重并測定染料木素和芹菜素的含量。

1.2.2不同IBA濃度對木豆不定根生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

剪取木豆不定根鮮重0.5 g，接種于100 mL分別添加了0.1、0.3、0.5、1.0 mg·L-1IBA的1/2MS+30 g·L-1蔗糖的液體培養(yǎng)基中，3次重復(fù)，于第25 d時收集樣品測定木豆不定根的鮮重、干重并測定染料木素和芹菜素的含量。

1.2.3不同濃度的MJ對木豆不定根生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

剪取木豆不定根鮮重0.5 g，接種于100 mL的1/2MS+30 g·L-1蔗糖的液體培養(yǎng)基中，于第15 d添加不同濃度的MJ(0，50，100，200 μmol·L-1)，3次重復(fù)，培養(yǎng)10 d收集樣品，測定木豆不定根的鮮重、干重并測定染料木素和芹菜素的含量。

1.2.4不同濃度的SA對木豆不定根生長及次生代謝產(chǎn)物的影響

剪取木豆不定根鮮重0.5 g，接種于100 mL的1/2MS+30 g·L-1蔗糖的液體培養(yǎng)基中，于第15 d添加不同濃度的SA(0，50，100，200 μmol·L-1)，3次重復(fù)，培養(yǎng)10 d收樣，測定木豆不定根的鮮重、干重并測定染料木素和芹菜素的含量。

1.2.5木豆不定根中染料木素和芹菜素含量的測定方法

染料木素和芹菜素的提取方法(超聲提取法)將收集的的木豆不定根樣品于60℃烘干，用研缽研磨成粉末，稱取一定量的樣品粉末于10 mL離心管中，按液料比40∶1加入70%乙醇，在60℃下超聲提取，在5 000 r·min-1下離心15 min，將沉淀物再次按照上述方法處理兩次，合并上清液，將上清液在70℃水浴條件下將其濃縮至一定體積，最后將提取液用0.45 μm的微孔濾膜過濾后用于HPLC檢測。

使用的HPLC系統(tǒng)由Waters 1525二元高效液相色譜儀、Waters 2478檢測器和Waters Sun Fire C18色譜柱(250 nm×4.6 mm，5 μm)組成。流動相為甲醇∶水∶甲酸=65∶34.935∶0.065(V∶V∶V)，流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫30℃，檢測波長260 nm。測得的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程來計(jì)算染料木素和芹菜素的含量。

表1標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

Table1Standardcurveequationsofreferencecompounds

次生代謝產(chǎn)物Secondary metabolite標(biāo)準(zhǔn)品—標(biāo)準(zhǔn)曲線Standard-standard curveR2值R2 value染料木素Genisteiny=105418.87x+132163.530.9998芹菜素Apigeniny=37105x-8447.20.9991

注：x.標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；y標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積

Note：x.Concentration of the standard product;y. Peak area of the standard product

1.2.6 木豆不定根鮮重及干重測定

不定根鮮重的測定：將木豆不定根從液體培養(yǎng)基中取出，用蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干水分后進(jìn)行稱量，即為鮮重。

不定根干重的測定：將木豆不定根從液體培養(yǎng)基中取出，用蒸餾水沖洗后，用濾紙吸干水分，放入40℃的烘箱中，烘干至恒重，即為干重。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度蔗糖對木豆不定根的影響

2.1.1 不同濃度蔗糖對木豆不定根生物量的影響

由表2可知，蔗糖濃度為10 g·L-1時，不定根分化少，生長極其緩慢；蔗糖濃度分別為20和30 g·L-1時，不定根生長狀況好，不定根分化多，生長旺盛，蔗糖濃度為30 g·L-1時，不定根鮮重為2.12 g和干重為0.30 g，均達(dá)到最大值。蔗糖濃度為40 g·L-1時，不定根出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，生長速度緩慢，分支少，這表明蔗糖濃度過高會抑制不定根的生長。因此，30 g·L-1蔗糖為木豆不定根培養(yǎng)的最佳碳源。

表2不同濃度蔗糖對木豆不定根生物量的影響

Table2EffectsofdifferentcontentsofsucroseonthebiomassofadventitiousrootsofC.cajan(Linn.)Millsp.

蔗糖濃度Sucrose content(g·L-1)鮮重Fresh weigh(g)干重Dry weight(g)不定根生長狀況Growth condition of adventitious roots100.82a0.06a分支少,生長極其緩慢The branches are small and grow extremely slowly201.72bc0.22c分支多而粗,生長速度較快The branches are large and thick and grow faster302.12c0.30d分支多而粗,生長速度快The branches are large and thick and grow faster401.47b0.17b分支少且玻璃化,生長速度較慢The branches are small and hyperhydric and grow slower

注：同列不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。

Note：Different letters within the same column indicates significant difference at 0.05 level,the same as below.

2.1.2不同濃度蔗糖對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響

從圖1可以看出，染料木素的含量在蔗糖濃度10～30 g·L-1范圍內(nèi)，隨著蔗糖濃度的提高而增加。蔗糖濃度為30 g·L-1時，其含量達(dá)到最大值為0.64 mg·g-1。蔗糖濃度為40 g·L-1時，染料木素的含量降低，這說明蔗糖濃度過高會抑制染料木素的合成；低濃度蔗糖有利于芹菜素的積累，蔗糖濃度為10 g·L-1時，芹菜素的含量為最大值0.07 mg·g-1，是蔗糖濃度為40 g·L-1時芹菜素含量的3.6倍，表明高濃度的蔗糖對芹菜素的合成起到抑制作用。

2.2 不同濃度IBA對木豆不定根影響

2.2.1 不同濃度IBA對木豆不定根生物量的影響

從表3數(shù)據(jù)及不定根的生長狀態(tài)可以看出，IBA濃度在0.1～1.0 mg·L-1范圍內(nèi)，有利于木豆不定根的生長，并且IBA濃度為0.1 mg·L-1時，不定根的鮮重和干重均達(dá)到最大值，分別為5.42和0.67 g。當(dāng)IBA濃度大于0.1 mg·L-1時，不定根的生長狀況均不良，不定根的生物量有所降低。因此得出低濃度IBA促進(jìn)不定根生長，高濃度IBA抑制不定根生長，適合木豆不定根生長的IBA的最佳濃度為0.1 mg·L-1。

圖1 不同濃度蔗糖對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響Fig.1 Effects of different contents of sucrose on the contents of genistein and apigenin

Table3EffectsofdifferentcontentsofIBAonthebiomassofadventitiousrootsofC.cajan(Linn.)Millsp.

IBA濃度IBA content(mg·L-1)鮮重Fresh weigh(g)干重Dry weigh(g)不定根生長狀況Growth condition of adventitious roots0.15.42b0.67c分支多而粗,生長速度快The branches are large and thick and grow faster0.33.87ab0.47b分支少且玻璃化,生長速度慢The branches are small and hyper-hydric and grow slower 0.54.34ab0.51b分支少且玻璃化,生長速度慢The branches are small and hyper-hydric and grow slower1.03.54a0.35a分支少且玻璃化, 生長速度慢The branches are small and hyper-hydric and grow slower

圖2 不同IBA濃度對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響Fig.2 Effects of different contents of IBA on the contents of genistein and apigenin

2.2.2不同IBA濃度對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響

如圖2可知，IBA濃度在0.1～1.0 mg·L-1時，染料木素的含量隨著IBA濃度的增加而降低，說明較高濃度的IBA對染料木素的合成表現(xiàn)出抑制作用。當(dāng)IBA濃度為0.1 mg·L-1時，染料木素含量達(dá)到最大值1.31 mg·g-1。當(dāng)IBA濃度為0.3 mg·L-1時，芹菜素含量最高，為0.12 mg·g-1，但與IBA濃度為0.1 mg·L-1時的芹菜素含量無顯著性差異，且當(dāng)IBA濃度大于0.3 mg·L-1時，芹菜素的合成降低，這說明高濃度的IBA對芹菜素的合成表現(xiàn)出抑制作用。

2.3 不同濃度的MJ對木豆不定根的影響

2.3.1不同濃度的MJ對木豆不定根生物量的影響

從表4可以看出，不同濃度的MJ處理中，木豆不定根生物量的累積無顯著差異(P>0.05)，木豆不定根分支多而粗，生長速度快，這表明在0～200 μmol濃度范圍內(nèi)，MJ對木豆不定根生物量幾乎無影響。

2.3.2不同濃度的MJ對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響

圖3表明，MJ濃度的范圍在0～200 μmol·L-1時，染料木素和芹菜素的含量隨著MJ濃度的增加呈先增加后降低的趨勢，并且兩者都在MJ濃度為100 μmol·L-1時，含量達(dá)到最大值，染料木素為0.83 mg·g-1，芹菜素為0.15 mg·g-1。這表明當(dāng)MJ濃度高于100 μmol·L-1時，會抑制木豆不定根次生代謝產(chǎn)物染料木素和芹菜素的合成。

2.4 不同濃度的SA對木豆不定根的影響

2.4.1 不同濃度的SA對木豆不定根生物量的影響

表4不同MJ濃度對木豆不定根生物量的影響

Table4EffectsofdifferentcontentsofMJonthebiomassofadventitiousrootsofC.cajan(Linn.)Millsp.

MJ濃度MJ content(μmol·L-1)鮮重Fresh weigh(g)干重Dry weigh(g)不定根生長狀況Growth condition of adventitious roots02.27a0.21a分支多而粗,生長速度快The branches are large and thick and grow faster502.39a0.3a分支多而粗,生長速度快The branches are large and thick and grow faster1001.66a0.21a分支多而粗,生長速度快The branches are large and thick and grow faster2001.69a0.24a分支多而粗,生長速度快The branches are large and thick and grow faster

圖3 不同濃度的MJ對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響Fig.3 Effects of different contents of MJ on the content of genistein and apigenin

從表5可以看出，SA濃度的范圍在0～200μmol·L-1時，木豆不定根的鮮重和干重在不添加SA的處理中均為最大值，分別為2.0和0.21 g。經(jīng)過SA處理過的不定根的生物量有所下降并且通過不定根的生長狀況可以看出，SA不僅抑制不定根的生長，而且影響生長狀態(tài)，不定根出現(xiàn)末端膨大，生長緩慢的現(xiàn)象。

表5不同SA濃度對木豆不定根生物量的影響

Table5EffectsofdifferentcontentsofSAonthebiomassofadventitiousrootsofC.cajan(Linn.)Millsp.

SA濃度SA content(μmol·L-1)鮮重Fresh weigh(g)干重Dry weigh(g) 不定根生長狀況Growth condition of adventitious roots02.02b0.21b分支多而粗,生長狀態(tài)好The branches are large and thick and grow in good condition501.64a0.16a分支多而粗, 末端膨大抑制生長The branches are large and thick and distal enlarge-ment inhibits growth1001.31a0.15a分支多而粗,末端膨大抑制生長The branches are large and thick and distal enlarge-ment inhibits growth2001.53a0.17a分支多而粗,末端膨大抑制生長The branches are large and thick and distal enlarge-ment inhibits growth

圖4 不同濃度的SA對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響Fig.4 Effects of different contents of SA on the content of genistein and apigenin

2.4.2不同濃度的SA對木豆不定根染料木素和芹菜素含量的影響

如圖4，SA的濃度范圍在0～200 μmol·L-1時，染料木素含量隨著SA濃度的增加而降低，即未經(jīng)SA處理的木豆不定根，染料木素的含量為最大值0.18 mg·g-1。芹菜素的含量在SA濃度為100 μmol·L-1時，其含量達(dá)到最大值0.03 mg·g-1，是未經(jīng)SA處理的1.5倍，可見SA明顯提高了木豆不定根中芹菜素的含量。

3 討論

本研究以1/2MS為基本培養(yǎng)基，篩選出了最佳蔗糖濃度，并在此基礎(chǔ)上分別研究了植物激素IBA、誘導(dǎo)子MJ及SA對木豆不定根生長和次級代謝產(chǎn)物染料木素、芹菜素合成的影響。

蔗糖作為植物組織培養(yǎng)中最常用的碳源，能支持絕大多數(shù)植物離體培養(yǎng)物的生長，一直被作為植物組織培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)碳源而廣泛應(yīng)用，蔗糖的用量不僅影響著培養(yǎng)物的生長速度和生長量，還影響其次生代謝產(chǎn)物的合成[18]。在低濃度蔗糖的培養(yǎng)基中，由于不定根得不到足夠的碳源，生長緩慢。然而蔗糖濃度過高會引起滲透壓過高從而導(dǎo)致細(xì)胞失水，使體細(xì)胞成熟，停止生長。郭肖紅研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基以30 g·L-1蔗糖為碳源且培養(yǎng)20 d時，丹參不定根增殖倍數(shù)最高；蔗糖濃度為60 g·L-1時，最適合丹參酮IIA合成，蔗糖濃度對原兒茶醛合成的量沒有顯著的影響[19]。培養(yǎng)基中蔗糖濃度為50 g·L-1時可使黃芩不定根生物量達(dá)到對照組(30 g·L-1)的1.62倍，黃芩苷的含量達(dá)到對照組的1.71倍[20]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，30 g·L-1蔗糖明顯促進(jìn)了木豆不定根生長和次生代謝產(chǎn)物合成，但當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到40 g·L-1時，對木豆不定根的生長和次生代謝產(chǎn)物的合成表現(xiàn)出明顯地抑制作用。這說明蔗糖對不定根的生長和次生代謝產(chǎn)物合成的影響因物種的不同而產(chǎn)生差異，不同的物種應(yīng)分別加以研究。

植物激素是培養(yǎng)基中重要的組成成分，不僅影響細(xì)胞生長，而且影響細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成。IBA是植物激素中天然合成的生長素，主要被用作誘導(dǎo)刺激細(xì)胞分裂和根的分化。IBA在根的誘導(dǎo)與生長上作用強(qiáng)烈，作用時間長，誘發(fā)的根多而長[21]。在人參的不定根研究中發(fā)現(xiàn)，IBA對不定根的生長和次生代謝產(chǎn)物的合成表現(xiàn)出明顯地促進(jìn)作用[22]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)IBA的濃度大于0.1 mg·L-1時，對木豆不定根的生長表現(xiàn)出明顯抑制作用，而且高濃度的IBA對染料木素和芹菜素的合成也表現(xiàn)出明顯抑制作用。0.1 mg·L-1的IBA對木豆不定根的生長和次生代謝產(chǎn)物的合成起到明顯促進(jìn)作用，可見IBA的濃度對木豆不定根的生長和次生代謝產(chǎn)物的合成具有重要影響。

MJ和SA均可作為植物防御反應(yīng)的信號分子，誘導(dǎo)植物中與抗逆有關(guān)的多種次生代謝物的合成。MJ和SA是兩種非常有效的誘導(dǎo)子，已在多種藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)中使用，且效果顯著[23～24]。研究表明丹參毛狀根培養(yǎng)18 d后，再用MJ處理9 d，丹參酮的含量為28.21 mg·L-1，是空白對照的4.9倍[25]。Shilpha等人研究表明，4 μmol·L-1MJ處理Solanum trilobatum毛狀根2周后，總黃酮含量顯著提高，達(dá)到(521.09 mg·g-1DW)[16]。朱葵榮等人研究發(fā)現(xiàn)一定范圍內(nèi)添加茉莉酸甲酯可以有效促進(jìn)黃芩不定根中黃芩苷的合成，且隨著茉莉酸甲酯濃度的增加，黃芩苷的含量逐漸提高。但是黃芩不定根的增長率隨著茉莉酸甲酯濃度的不斷增大持續(xù)降低，這表明茉莉酸甲酯對黃芩不定根的生長產(chǎn)生抑制作用，濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。他們還研究發(fā)現(xiàn)低濃度水楊酸對黃芩不定根生長及黃芩苷合成均起到促進(jìn)作用，當(dāng)其濃度為4 mg·L-1時，不定根的生物量及黃芩苷含量均達(dá)到最大[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MJ濃度的范圍在0～200 μmol·L-1時，對木豆不定根的生長幾乎無影響，但當(dāng)MJ的濃度大于100 μmol·L-1時，對次生代謝產(chǎn)物的合成表現(xiàn)出抑制作用。SA對木豆不定根生長表現(xiàn)出抑制作用，對芹菜素的合成表現(xiàn)出一定促進(jìn)作用，但對染料木素的合成表現(xiàn)出抑制作用。可見誘導(dǎo)子處理刺激培養(yǎng)物合成次生代謝產(chǎn)物的效果受誘導(dǎo)子種類及濃度等因素的影響，對于不同的培養(yǎng)體系，應(yīng)進(jìn)行深入研究。

已有文獻(xiàn)研究表明，不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)的聯(lián)合使用與單一調(diào)節(jié)物質(zhì)使用相比，具有作用強(qiáng)、產(chǎn)量高，底物選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)[26]。崔北米在研究中發(fā)現(xiàn)植物激素ABA和乙烯利共同處理丹參毛狀根能顯著提高迷迭香酸的含量，且高于ABA單獨(dú)處理效果[27]。徐立新等人研究表明誘導(dǎo)子MJ與SA對人參皂苷含量的增加具有明顯的協(xié)同作用，當(dāng)其濃度均為0.001 mmol·L-1時，對總皂苷和單體皂苷的積累比二者單獨(dú)作用要大[28]。雖然外源調(diào)節(jié)物質(zhì)(如植物激素、誘導(dǎo)子等)的聯(lián)合使用在一定程度上提高了多種藥用植物活性成分的產(chǎn)量，但是由于不同外源調(diào)節(jié)物質(zhì)間相互作用太復(fù)雜，其誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制目前并不清晰[26]。關(guān)于多種影響因子對木豆不定根生長和次生代謝產(chǎn)物合成的影響，在今后的研究中要進(jìn)行深入研究。

到目前為止，有關(guān)木豆不定根的研究尚未見報道。本研究結(jié)果表明木豆不定根的懸浮培養(yǎng)是獲得次生代謝產(chǎn)物的一條有效途徑，為大規(guī)模生產(chǎn)染料木素和芹菜素奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

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