王立剛

摘 要：目的：鑒定蘋果樹腐爛病拮抗細(xì)菌，測(cè)定其抑菌作用。方法：研究所周圍四個(gè)縣內(nèi)20個(gè)蘋果園中的110份蘋果樹腐爛病病皮，進(jìn)行接抗菌鑒定，通過(guò)培養(yǎng)、染色方法，觀察接抗菌的性狀，提取DNA，鑒定。將獲得的拮抗劑制作稀釋液，接種到蘋果樹腐爛病菌餅周圍，進(jìn)行抑菌率分析。結(jié)果：共檢出了3種抑菌率尚可的細(xì)菌，編號(hào)AC-1、AC-5、DF-3，分別來(lái)源于枝條、枝條、土壤。AC-1、AC-5、DF-3三種接抗菌隨著倍數(shù)的上升，對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制率呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。顯微鏡下分析，抑制試驗(yàn)后的蘋果樹腐爛病菌出現(xiàn)更多的內(nèi)含物溢出、菌絲斷裂、畸形，浸染力下降。結(jié)論：就近采樣進(jìn)行鑒定，可獲得蘋果樹腐爛病拮抗細(xì)菌，稀釋液仍然有較好的抑菌作用，但會(huì)明顯下降。

關(guān)鍵詞：蘋果樹腐爛?。晦卓?；抑菌作用

蘋果是一種常見(jiàn)的水果，我國(guó)是世界蘋果生產(chǎn)大國(guó)。蘋果樹腐爛病是威脅蘋果產(chǎn)業(yè)的常見(jiàn)疾病，是一種真菌病害，患病果樹幾乎喪失結(jié)果能力，常有80%的果樹需要鋸掉果枝或樹干，造成果園喪失生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。蘋果樹腐爛病治療方法較多，其中生防法為主要方法，發(fā)展?jié)摿^大。本次研究嘗試鑒定蘋果樹腐爛病拮抗細(xì)菌鑒定，評(píng)價(jià)其抑菌能力。

一、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

研究所周圍四個(gè)縣內(nèi)20個(gè)蘋果園中的110份蘋果樹腐爛病病皮。

2.儀器與試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NA）培養(yǎng)基，搖床，各種濃度的乙醇，顯微鏡，染色液、助染劑的供試染液，電泳儀、電熱恒溫水槽，凝膠成像系統(tǒng)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)等。

3.方法

（1） 拮抗菌鑒定。首先：獲得菌株，常規(guī)組織塊分裂方法，直接從病變樹皮的邊緣分離，獲得完整、無(wú)污染的病變樹皮。75%乙醇表面消毒，挑取真菌實(shí)體，種植在PDA培養(yǎng)基上，25%孵育箱中培養(yǎng)，獲得菌落、單孢分離株，4℃?zhèn)溆谩Ｆ浯?，進(jìn)行致病性驗(yàn)證以及形態(tài)學(xué)觀察，采用顯微鏡下對(duì)比實(shí)驗(yàn)室致病性驗(yàn)證、果園采集的病變樹皮及你想對(duì)比，鑒定實(shí)體的大小、形態(tài)特征。再次，進(jìn)行拮抗菌的分離、篩選，取風(fēng)干過(guò)篩的土壤10g，加入90ml，無(wú)菌水，28℃、180r/min，震蕩2h，掛取獲得蘋果樹腐爛病真菌，進(jìn)行接種鑒定，28℃培養(yǎng)24h。再次，進(jìn)行接抗菌的篩選，采用平板對(duì)峙法進(jìn)行篩選，花卉采用游標(biāo)卡尺測(cè)量病原菌的直徑，計(jì)算抑菌率，篩選接抗菌。進(jìn)行接抗菌的鑒定，通過(guò)培養(yǎng)、染色方法，觀察接抗菌的性狀，提取DNA。

（2） 抑菌分析。將獲得的接抗菌，進(jìn)行抑制作用。將活化好的細(xì)菌（A、B、C種），接種在NB培養(yǎng)基28℃，180r/min，培養(yǎng)48h，高速離心10000r/min，30min，取上清液，細(xì)菌過(guò)濾器上過(guò)濾，涂布在NA培養(yǎng)基，無(wú)菌下封裝，無(wú)菌發(fā)酵，獲得原液，進(jìn)行稀釋，制備稀釋液。采用玻片法進(jìn)行孢子萌發(fā)試驗(yàn)，進(jìn)行抑菌率分析（抑制率=[（對(duì)照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率）/對(duì)照萌發(fā)率）]×100。將蘋果腐爛病菌采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)接到另外一個(gè)培養(yǎng)基。分別將三種拮抗劑無(wú)菌發(fā)酵液接種在病原菌對(duì)稱的四個(gè)方向，距離2cm左右，濃度為原液、200、400倍，制作藥劑對(duì)照，以無(wú)菌水作為空白對(duì)照，25℃培養(yǎng)箱按培養(yǎng)，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。最后，將接抗菌無(wú)菌發(fā)酵液稀釋200備，接種在PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，1周后從病菌菌落邊緣挑取少量的菌絲，顯微鏡下觀察形態(tài)、顏色改變情況。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，抑制率服從正態(tài)分布，采用（Mean±SD）（ ±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，三組間比較采用F檢驗(yàn)，顯微鏡檢查情況采用描述性分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、 結(jié)果

1.鑒定結(jié)果

共檢出了3種抑菌率尚可的細(xì)菌，編號(hào)AC-1、AC-5、DF-3，分別來(lái)源于枝條、枝條、土壤，抑菌率分別為（68.4±5.6）%、（67.5±8.1）%、（58.0±9.4）%。檢出了44種細(xì)菌，3種抑菌率≥50%，抑菌率在0%～69之間。

2.抑菌結(jié)果分析

AC-1、AC-5、DF-3三種接抗菌隨著倍數(shù)的上升，對(duì)蘋果樹腐爛病菌的抑制率呈下降趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。顯微鏡下分析，抑制試驗(yàn)后的蘋果樹腐爛病菌出現(xiàn)更多的內(nèi)含物溢出、菌絲斷裂、畸形，浸染力下降。

三、討論

蘋果樹腐爛病拮抗細(xì)菌有潛力作為疾病的治療，從周圍環(huán)境包括枝條、土壤，最有可能獲得接抗菌。本次研究顯示，從土壤、枝條獲得44種細(xì)菌，3種抑菌率≥50%，抑菌率在0%～69之間。鑒定及其抑菌作用效果存在一定的差異，在55～69之間。需要注意的是，隨著三種接抗菌倍數(shù)的上升，其仍然有明顯的拮抗作用。鏡下檢查發(fā)現(xiàn)，抑制試驗(yàn)后的蘋果樹腐爛病菌出現(xiàn)更多的內(nèi)含物溢出、菌絲斷裂、畸形，浸染力下降，接抗菌可能會(huì)通過(guò)削弱病原菌的侵染能力、殺滅病原菌發(fā)揮拮抗作用。

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