雒志新，閆 強(qiáng)，代冬梅, 張智英，王 昕

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

載脂蛋白是指血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)部分，此類蛋白有識別受體、激活脂蛋白代謝酶等功能。載脂蛋白ApoE是一條單一的相對分子量為34 kD的多肽鏈糖蛋白，主要由肝臟合成和分泌，它在哺乳動物血液循環(huán)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽固醇和脂質(zhì)的運輸中承擔(dān)著重要的作用[1-2]。人類的ApoE蛋白具有多態(tài)性，它有三種亞型：E2, E3和 E4。它們的區(qū)別在于ApoE肽鏈第112和158位的氨基酸的不同[3]，其遺傳多樣性與人類多種神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)癥狀有關(guān)[4-5]。

近年來，CRISPR/Cas9作為第三代基因編輯技術(shù)[6]，已經(jīng)成功應(yīng)用于各種模型動物的構(gòu)建中[7-9]。典型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)由有DNA切割活性的Cas9核酸酶和通過堿基互補(bǔ)配對引導(dǎo)Cas9定點切割的gRNA組成[10-11]。與前兩代人工核酸酶ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9具有高效、成本低廉及易于組裝等優(yōu)點。本實驗室前期構(gòu)建的RG和RPG報告載體[12-13]，可以通過單鏈退火(single strand annealing, SSA)修復(fù)核酸酶造成的DNA斷裂，并由報告基因的表達(dá)來反映核酸酶的工作情況，結(jié)合流式細(xì)胞儀或藥物篩選的方式可以富集到經(jīng)過人工核酸酶基因編輯過陽性細(xì)胞[14], 其高效性已經(jīng)被多次驗證[13,15-16]。

由于豬與人類新陳代謝和疾病免疫方面的高度相似性，已經(jīng)成為研究人類疾病的重要模型動物[17]。本試驗旨在利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)和相應(yīng)的報告載體，實現(xiàn)對豬ApoE基因的定點敲除，為后期構(gòu)建ApoE敲除豬的動物模型提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒 HEK293T細(xì)胞、PK15細(xì)胞、JM109感受態(tài)細(xì)胞和PX330質(zhì)粒均為本實驗室保存；RG (Red-GFP)和RPG (Red-PuroR-GFP) 報告載體為本實驗室前期構(gòu)建[12-13]。

1.1.2 材料和試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶均購自NEB公司，質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒購自Sigma公司，Sofast轉(zhuǎn)染試劑購自廈門太陽馬生物工程有限公司。

1.1.3 引物合成和測序 利用在線軟件(http://crispr.mit.edu)，輸入豬ApoE基因序列，分別設(shè)計兩個靶位點5'-GGAGGACGTGCGCAACCGCT-3'和5'-CTTGGTGCTCTACCGCAGCG-3'；用Primer6設(shè)計包含靶序列的引物，序列見表1。引物合成及測序由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體的構(gòu)建 將引物Apoe1 sgRNA F/Apoe1 sgRNA R、Apoe2 sgRNA F/ Apoe2 sgRNA R (表1) 兩對引物分別擬合后與經(jīng)過BsaI酶切后的PX330載體連接，轉(zhuǎn)化涂板后，挑取單克隆。提取的質(zhì)粒酶切鑒定后，送陽性單克隆測序。將構(gòu)建正確的質(zhì)粒分別命名為sgRNA1、sgRNA2。

表1 用于質(zhì)粒構(gòu)建和測序的引物序列Table 1 Primers used for vector construction, detection and sequencing

1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)報告載體的構(gòu)建 以豬基因組為模板，利用引物BamHI.ApoE.F /NotI.ApoE.R (表1)對含有靶序列的目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增片段用BamHI和NotI酶切后，插入到同樣酶切后的RG和RPG報告載體。將酶切正確的克隆分別利用PEGFP-F：5'-CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG-3'， pCAG-F：5'-GCAACGTGCTGGTTATTGTG-3'測序，將結(jié)果正確的質(zhì)粒分別命名為RG-ApoE、RPG-ApoE。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T和PK15細(xì)胞均培養(yǎng)在含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基，并放置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.4 CRISPR/Cas9表達(dá)載體活性驗證 將適量HEK293T細(xì)胞接種到24孔板，待其生長融合度至50%～80%時，采用Sofast推薦體系，將CRISPR/Cas9表達(dá)載體和RG-ApoE報告載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞。48 h后，通過倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)光結(jié)果，并利用流式細(xì)胞儀對RFP+和GFP+陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。RFP+細(xì)胞代表了被成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，RFP+GFP+細(xì)胞代表了被打靶陽性細(xì)胞。CRISPR/Cas9表達(dá)載體活性通過RFP+GFP+陽性細(xì)胞數(shù)與RFP+陽性細(xì)胞數(shù)的比率計算。

1.2.5 基因組檢測 將CRISPR/Cas9表達(dá)載體和RPG-ApoE報告載體共轉(zhuǎn)至PK15細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，加入嘌呤霉素(終濃度為3.0 μg/mL)對細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選5 d后，停止加嘌呤霉素。2 d后，收集細(xì)胞，提取基因組。以基因組為模版，利用Seq ApoE F(5'-GGGTCAGTCTTGCCGTCCTT-3')和NotI.ApoE.R (表 1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將目的片段回收后，與T載體連接。經(jīng)過轉(zhuǎn)化涂板，隨機(jī)挑取15個單克隆測序。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效率通過陽性克隆數(shù)與挑選的總克隆數(shù)的比率計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體和報告載體的構(gòu)建

含有靶序列的PCR片段瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖1， PCR片段大約為139 bp。 進(jìn)一步測序結(jié)果表明，靶向豬ApoE基因的兩個表達(dá)載體sgRNA1、sgRNA2(圖2)和相應(yīng)的RG-ApoE，RPG-ApoE報告載體均成功構(gòu)建(圖3，圖4)。

圖1 豬ApoE基因PCR片段電泳檢測M.Trans2K○R Plus DNA Marker (Transgen)；1.樣品Fig.1 Electrophoresis detection of porcineApoE gene PCR fragmentsM.Trans2K○R Plus DNA Marker (Transgen)；1.DNA sample

圖2 表達(dá)載體sgRNA1和sgRNA2測序結(jié)果Fig.2 Sanger sequencing results of expressing vector sgRNA1 and sgRNA2

圖3 RG-ApoE報告載體測序結(jié)果方框中的序列為sgRNA的PAM序列。下同。Fig.3 Sequencing results of reporter vector RG-ApoESequences in boxes are PAM sequence of sgRNA.The same below.

圖4 RPG-ApoE報告載體測序結(jié)果Fig.4 Sequencing results of reporter vector RPG-ApoE

2.2 CRISPR/Cas9表達(dá)載體活性驗證

將CRISPR/Cas9表達(dá)載體和RG-ApoE報告載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞48 h后，當(dāng)CRISPR/Cas9表達(dá)載體工作時，RG-ApoE報告載體在靶序列處發(fā)生DNA雙鏈斷裂(Double Strand Break, DSB)，并通過單鏈退火擬合SSA的方式修復(fù)，原本在兩端被靶序列間隔的標(biāo)記基因GFP被修復(fù)而得以正常表達(dá)(圖5)。倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，試驗組(圖6中b和c)sgRNA1、sgRNA2 均可觀察到GFP和RFP的表達(dá)，而陰性對照組只觀察到RFP(圖6 NC)。熒光觀察結(jié)果顯示構(gòu)建的靶向豬ApoE基因的CRISPR/Cas9在報告載體水平均表現(xiàn)出較高的活性。利用流式細(xì)胞儀對RFP和GFP陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，結(jié)果表明sgRNA1、sgRNA2的活性分別為6.50%和6.83%(圖7)。

圖5 RG報告載體的工作原理示意圖當(dāng)CRISPR/Cas9正常工作時，陽性細(xì)胞將既發(fā)紅光又發(fā)綠光，否則只發(fā)紅光。Fig.5 The schematic illustration of the RG surrogate reporter Both red and green fluorescence would be observed when CRISPR/Cas9 work as expected, otherwise only red fluorescence could be observed.

2.3 基因組檢測

與RG-ApoE報告載體原理相同，當(dāng)CRISPR/Cas9正常工作時，RPG-ApoE報告載體在靶序列附近會形成DSB，被其間隔的標(biāo)記基因PuromysinR由于SSA修復(fù)而恢復(fù)抗性基因的功能(圖8)，同時用倒置熒光顯微鏡觀察到與PuromysinR融合的GFP基因也能夠正常表達(dá)(圖9)。將經(jīng)過嘌呤霉素篩選后富集到的PK15細(xì)胞提取基因組后，用Seq ApoE F和NotI.ApoE.R (表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR片段及TA克隆測序結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sgRNA1、sgRNA2的PK15細(xì)胞均在靶序列附近檢測到突變(圖10，圖11)，且突變的概率分別為40%、53.3%。

圖6轉(zhuǎn)染HEK293T 48h后熒光觀察結(jié)果
NC.陰性對照組；a.轉(zhuǎn)染sgRNA1和RG報告載體；b.轉(zhuǎn)染sgRNA2和RG報告載體；c.sgRNA1，sgRNA2和RG報告載體共轉(zhuǎn)染組。
Fig.6 Representative visualization of fluorescence after transfection of HEK293T for 48 h
NC. negative control; a, transfected with sgRNA1 and the surrogate reporter (molar ratio 1:1); b. transfected with sgRNA2 and the surrogate reporter; c. transfected with sgRNA1, sgRNA2 and the RPG reporter (molar ratio 3:3:4)

圖7 流式細(xì)胞儀對DsRed+和DsRed+eGFP+細(xì)胞計數(shù)結(jié)果Q1. DsRedC+ GFP-；Q2. DsRed+ GFP+；Q3. DsRed- GFP+；Q4. DsRed- GFP-。Fig.7 Flow cytometric quantification results of the DsRed+ and DsRed+GFP+ cells Q1. DsRed+ GFP-;Q2. DsRed+ GFP+;Q3. DsRed- GFP+;Q4. DsRed- GFP-.

3 討 論

目前，基因編輯豬作為動物模型，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類疾病研究中[7,9,18]。ApoE基因序列和氨基酸序列與人類高度同源[19]。熒光原位雜交結(jié)果顯示豬的ApoE基因位于第6號染色體q2.1，由四個外顯子和三個內(nèi)含子組成[19]。有研究顯示ApoE蛋白主要在腦組織和肝臟中合成，是低密度脂蛋白受體和脂蛋白受體關(guān)聯(lián)蛋白的配體，它會攝取低密度脂蛋白，參與血液循環(huán)系統(tǒng)中膽固醇和甘油三酯的代謝過程，對肝臟清除剩余脂蛋白起到重要的作用[4-5，20]。ApoE基因敲除兔與野生型兔相比，更容易出現(xiàn)高血脂和動脈硬化[8]。此外，ApoE還參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。大量研究表明ApoE蛋白的E4亞型會強(qiáng)烈地誘發(fā)阿爾茲海默癥。ApoE基因敲除鼠除了表現(xiàn)出高血脂和動脈硬化，還出現(xiàn)記憶和行為的錯亂[21]。總之，ApoE基因的異常與心腦血管疾病，如高血脂，糖尿病，動脈粥樣硬化和阿爾茲海默癥密切相關(guān)[22]。ApoE基因敲除動物模型的構(gòu)建對研究心血管疾病分子機(jī)理和臨床治療有重要的意義。雖然ApoE基因敲除鼠和兔已經(jīng)被報道[8]，但是由于豬與人類在免疫和新陳代謝方面的具有更高的相似性，因此構(gòu)建ApoE基因敲除豬疾病模型，對于研究人類心血管疾病更具有臨床意義。盡管李奎等利用CRISPR/Cas9成功生產(chǎn)出ApoE和LDLR雙基因敲除的豬[23]，但是ApoE單基因敲除的豬動物模型還未見報道。

圖8 RPG報告載體工作原理示意圖當(dāng)CRISPR/Cas9正常工作時，陽性細(xì)胞將既紅光又發(fā)綠光，并且具有嘌呤霉素抗性。Fig.8 Schematic illustration of our RPG reporter Once the CRISPR/Cas9 worked as expected, the geneDs-red, PuromycinR and GFP genes would be expressed.

圖9 轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞4 d后熒光觀察結(jié)果Fig. 9 Visualization of DsRed and GFP expression in PK15 cells after 4d of transfection

圖11 PK15細(xì)胞轉(zhuǎn)染sgRNA2后ApoE基因測序結(jié)果(嘌呤霉素篩選)Fig. 11 Sequencing results of ApoE gene after transfection of PK15 cells to sgRNA2(after puromycin screening)

CRISPR/Cas9作為相對成熟的基因編輯技術(shù)，由于其高效、成本低廉和易于組裝等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種研究中[7-9,16]。本試驗設(shè)計了靶向豬ApoE基因第三外顯子的兩個sgRNA。為了驗證這兩個sgRNA介導(dǎo)Cas9蛋白打靶的活性，同時還構(gòu)建了含有靶序列的具有篩選富集陽性細(xì)胞功能的RG和RPG報告載體。RG報告載體雖然不能通過藥物篩選富集陽性細(xì)胞，但是在HEK293T中通過觀察陽性細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)，可以表明我們構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠在靶序列處造成DNA雙鏈斷裂，并觸發(fā)報告載體進(jìn)行SSA修復(fù)。經(jīng)過流式細(xì)胞儀對GFP+和RFP+GFP+在HEK293T細(xì)胞的計數(shù)結(jié)果表明，sgRNA2活性略高于sgRNA1。此外，sgRNA1和sgRNA2共轉(zhuǎn)染可以顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效率。此結(jié)果的原因可能為：①CRISPR/Cas9系統(tǒng)的活性極大地依賴于sgRNA的序列和結(jié)構(gòu)，GC含量均勻的sgRNA活性高于GC含量較低或較高的sgRNA[24]；②對于sgRNA1/sgRNA2共轉(zhuǎn)染組，只要其中的一對sgRNA工作，GFP基因就會表達(dá)。所以共轉(zhuǎn)染組的活性大約是單個sgRNA組的兩倍。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的工作效率還會受到細(xì)胞類型和轉(zhuǎn)染效率的制約。我們利用構(gòu)建的RPG報告載體，通過嘌呤霉素藥物篩選成功富集到ApoE基因被CRISPR/Cas9編輯過的陽性PK15細(xì)胞。測序結(jié)果顯示sgRNA1和sgRNA2在基因組敲除的效率分別為40%和53.3%。雖然在HEK293T細(xì)胞上表明sgRNA1和sgRNA2共轉(zhuǎn)染可以顯著提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的打靶效率，但是由于三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染顯著地降低了PK15細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，未能在共轉(zhuǎn)染組觀察到GFP的表達(dá)，也沒有通過藥物篩選富集到足夠多的陽性細(xì)胞。

ZFN系統(tǒng)和TALEN系統(tǒng)由鋅指或轉(zhuǎn)錄激活類似物蛋白和FoKI核酸酶構(gòu)成，這使得他們在構(gòu)建時，需要對鋅指或轉(zhuǎn)錄激活類似物蛋白進(jìn)行改造，過程相對繁瑣。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建只需要在已有的基礎(chǔ)上對sgRNA中20nt的靶向序列進(jìn)行替換即可。本研究結(jié)果表明，通過設(shè)計針對于豬ApoE基因的sgRNA構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)、結(jié)合具有富集陽性細(xì)胞作用的RPG報告載體，可以實現(xiàn)對豬ApoE基因的有效敲除。該結(jié)果為構(gòu)建ApoE敲除豬動物模型提供了有力的技術(shù)支持。

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