劉慶豐 ，于 帥 ，孫甜甜，李 敏 ，叢竹鳳 ，高 鵬，代 龍

土鱉蟲，又稱蟲、地鱉蟲、土元等，始載于《神農本草經》，是中國傳統(tǒng)的具有活血化瘀功效的動物藥。古代著名醫(yī)家劉完素曾說道：“郁而不散為壅，必以宣劑以散之。”又如清代醫(yī)家葉天士曰：“久則邪正混處其間，草木不能見效，當以蟻蟲疏通逐邪?！敝赋鐾流M蟲、水蛭、天龍等善于鉆入狹縫孔隙的動物藥，有化瘀通絡、祛瘀生新的功效。其雌蟲體具有散血瘀、消堅結、解凝活血、接骨續(xù)筋、消腫止痛、下乳通經等功效[1]。有文獻報道其對血液流變性各參數(shù)的改善作用較強，進一步證明其較強的活血化瘀作用[2]。土鱉蟲的主要活性成分包括多種活性蛋白質（酶）、氨基酸、生物堿、脂溶性維生素及脂肪酸、微量元素、揮發(fā)油等，以及分離得到的核苷類化合物尿嘧啶和尿囊素，有鎮(zhèn)靜作用且外用有促進皮膚潰瘍面和傷口愈合及生肌作用[3]。

1 實驗材料

1.1 儀器 R－301型旋轉蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）；CT－241電滲析儀（浙江賽特膜技術有限公司）；卷式超濾膜（1KDa、3KDa）（北京市旭邦膜設備有限責任公司）；LGJ－10C型真空冷凍干燥機（杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；AL－204型萬分之一天平；KQ－500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；UV－1100型紫外－可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；ermeGear垂直透皮擴散滲透儀（上海玉研科學儀器有限公司）。

1.2 試藥及試劑 胰蛋白酶（批號F20071228），酶活力 2 000 U/mg；胃蛋白酶（批號 F20110712），酶活力3 000 U/mg（均購自上海藍季科技發(fā)展有限公司產品）；分子量標準品：牛血清白蛋白（MW66430）（上海源葉生物科技有限公司）。

土鱉蟲藥材（雌蟲干燥體，購自濟南建聯(lián)中藥店），經山東中醫(yī)藥大學郭慶梅老師鑒定為鱉蠊科中華真地鱉（Eupolyphaga sinensis Walker）的雌蟲干燥體。

硫化鈉、氯化鈉、丙三醇、三乙醇胺、氮酮，以上試劑均為分析純，卡波姆940，蒸餾水。

SD 大鼠，SPF 級，體質量 200～250 g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證為SCXK（魯）201300010。

2 方法與結果

2.1 土鱉蟲活性小肽制備 將土鱉蟲藥材粉碎過60目篩，取1 000 g，加10倍量純水，煮沸20 min，待水液降溫至40℃，用稀鹽酸溶液調pH至1.5左右，加胃蛋白酶適量，40℃保溫酶解2 h；再用稀氫氧化鈉溶液調pH至8.0左右，加入胰蛋白酶適量，40℃保溫酶解4 h[4]；煮沸10 min滅酶，迅速冷卻至室溫，放置冰箱低溫（4℃左右）冷藏過夜，離心（4 500 r/min）10 min，取上清液經電滲析儀除鹽得土鱉蟲酶解液[5]，再依次用過分子截留量為3 KDa、1 KDa的超濾膜進行超濾，得到不同分子量的土鱉蟲活性小肽組分，低溫減壓濃縮（65℃，－0.07～－0.08 MPa）后進行凍干得不同分子量土鱉蟲活性小肽凍干粉（P1：M＜1 KDa，P2：1 KDa＜M＜3 KDa，P3：M＞3 KDa），滅菌后－20℃低溫保存。

2.2 總肽含量測定

2.2.1 溶液的配制 對照品溶液的制備：精密稱定牛血清白蛋白對照品適量，加水制成每1 mL含0.2 mg的溶液，即得。

土鱉蟲活性小肽溶液的制備：分別取土鱉蟲活性小肽凍干粉（P1：6.45mg、P2：3.12mg、P3：6.35mg），用純凈水定容至25 mL容量瓶中，搖勻，制得P1樣品溶液、P2樣品溶液、P3樣品溶液。

2.2.2 測定方法 按照文獻采用福林酚比色法測定總肽含量[6]，依次測定對照品及P1樣品溶液、P2樣品溶液、P3樣品溶液的吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=0.482 5X+0.029 7（r2=0.997 6），并計算不同分子量土鱉蟲活性小肽的總肽含量。結果見表1。

表1 不同分子量土鱉蟲活性小肽肽含量均值（n=3）

實驗結果得出，3種不同土鱉蟲溶液中，均含有活性肽，其中P2溶液中含肽量最高，占總質量的70.84%，P1溶液中含肽量最少，占總質量的40.13%。

2.3 不同分子量土鱉蟲活性小肽凝膠體外透皮特性研究

2.3.1 土鱉蟲活性小肽凝膠的制備 凝膠基質配方：卡波姆940，30 g（提前加入蒸餾水中充分溶脹成1%的溶液），丙三醇4 g，土鱉蟲活性小肽0.2 g，蒸餾水15 mL，氮酮1 g，三乙醇胺0.1 g，共計50 g。

不同凝膠樣品制備：將不同分子量的土鱉蟲活性小肽P1、P2、P3溶于15 mL蒸餾水中，加入充分溶脹的卡波姆溶液，混勻，依次加入甘油、氮酮，邊攪拌邊滴加三乙醇胺至凝膠pH為7左右[7]，即得土鱉蟲活性小肽P1凝膠樣品、P2凝膠樣品、P3凝膠樣品。

離體鼠皮制備：取SD大鼠，斷頸處死，立即剝離大鼠腹部及背部皮膚，用8%硫化鈉溶液脫毛，并小心剔除多余皮下組織，再用生理鹽水清洗干凈，于4℃保存?zhèn)溆茫?周內用完。實驗前檢查皮膚的完整度，避免破損。

2.3.2 透皮擴散實驗方法 將處理好的皮膚固定于Franz擴散池，供給池與接收池之間，角質層面向供給池，接收池注滿生理鹽水并排凈氣泡，取1 g凝膠均勻涂布于鼠皮上，300 r/min，37℃保溫開始計時，分別于 1、2、4、6、8、10、12、24 h，取出全部接收液并立即補加等量的接收液，接收液濃縮至1.5 mL，再進行肽含量測定[8－10]。其中，接收池體積為15 mL，有效透過面積為3.14 cm2。

式中Q為累積滲透率，Cn為t時接收液肽濃度，V為接收液體積，m0為凝膠含有的初始肽量。以累積滲透率Q（%）對時間t（h）作圖，得累計透皮曲線。

2.3.3 土鱉蟲活性小肽水溶液與凝膠劑透皮性比較 按照2.3.1項下方法分別制備P1、P2、P3凝膠樣品，并制備等濃度的小肽水溶液樣品，采用上述透皮擴散實驗方法，比較P1、P2、P3水溶液與凝膠劑在大鼠皮膚中的滲透性。結果見表2。

結果表明，P1、P2、P3凝膠劑在大鼠皮膚中的滲透效果均優(yōu)于水溶液，透皮吸收率均明顯提高，說明將土鱉蟲活性小肽制成凝膠劑型有利于提高其滲透性，由于凝膠基質中含有氮酮等促滲劑成分，因此滲透性要比水溶液好很多。

表2 P1、P2、P3水溶液與凝膠劑累計滲透率比較

2.4 體外透皮擴散實驗

2.4.1 不同大鼠皮部位對土鱉蟲活性小肽P1凝膠劑透皮性的影響 按照2.3.1項下方法制備土鱉蟲活性小肽P1凝膠樣品，并按2.3.1項下方法制備大鼠腹部及背部皮膚，采用上述透皮擴散實驗方法，比較小肽P1凝膠在大鼠不同皮膚部位中的滲透性，結果見表3。

表3 不同大鼠皮部位對P1凝膠累計滲透率比較

結果表明，背部皮膚累計滲透率為54.03%，明顯小于腹部皮膚96.19%，單位面積滲透量腹部是背部的1.74倍，因此，實驗選擇大鼠腹部皮膚進行體外透皮實驗。

2.4.2 不同促滲劑對土鱉蟲活性小肽P1凝膠劑透皮性的影響 按照2.3.1項下方法分別制備含3%氮酮、3%PEG400、3%油酸不同促滲劑的小肽P1凝膠樣品，采用上述透皮擴散實驗方法，比較同濃度不同促滲劑對P1凝膠在大鼠皮膚中滲透性差異。結果見表4。

表4 不同促滲劑對小肽P1累計滲透率比較

結果表明，3種不同促滲劑對P1的滲透效果：氮酮＞油酸＞PEG400，且氮酮的單位面積滲透量分別是PEG400、油酸的1.77倍、1.54倍，說明氮酮的促滲效果更好，這可能與氮酮對皮膚的作用機制有關，它在細胞間類脂膜雙分子層結構中發(fā)生作用，使其致密性降低，流動性增加[11]。

2.4.3 不同濃度氮酮對土鱉蟲活性小肽P1凝膠劑透皮性的影響 按照2.3.1項下方法分別制備含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮小肽P1凝膠樣品，采用上述透皮擴散實驗方法，比較不同濃度氮酮對P1凝膠滲透性的影響。結果見表5。

表5 不同濃度氮酮對小肽P1累計滲透率比較

結果表明，3種濃度的氮酮對土鱉蟲活性小肽的促滲作用基本無區(qū)別[12]，選取1%氮酮作為滲透劑即可滿足實驗要求。

3 討論

通過本實驗，采用酶解方法和超濾法得到3種不同分子量的物質，分別為P1、P2、P3。同時folin肽含量測定方法對3種物質進行肽含量測定，得出含肽量順序為 P2＞P3＞P1。但是通過對比 P1、P2、P3 凝膠及其水溶液的累計滲透率，得出分子量越小的透皮性越好，即P1凝膠透皮效果最佳。并通過不同大鼠皮膚透過實驗，得出P1凝膠在大鼠腹部皮膚透皮效果更好，P1凝膠累計滲透率可達94.26%。通過對比含3%氮酮、3%PEG400、3%油酸不同促滲劑的小肽P1凝膠樣品，3%氮酮對P1凝膠樣品促滲作用更強，累計滲透率達96.43%。同時對比含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮小肽P1凝膠樣品，最后得出不同濃度氮酮對P1凝膠滲透性影響差異不大。

根據(jù)人體皮膚吸收原理，分子量越小的物質越易被皮膚吸收，本實驗得出土鱉蟲活性小肽3種物質中的P1透皮效果優(yōu)于其他兩種物質，佐證了這一吸收原理，但是土鱉蟲活性小肽P1組分中可能含有游離氨基酸，氨基酸分子量小，易被人體皮膚吸收，這可能是造成P1組分透皮吸收率高的原因之一。后期實驗需對P1組分進行進一步純化，去除游離氨基酸后再進行透皮實驗。

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