曹銘晨，方孟香，黃 欣

鬼針草，又名婆婆針，為菊科一年生植物鬼針草（Bidensbipinnat a L.）的干燥全草，中國大部分地區(qū)均有分布。鬼針草始載于唐代《本草拾遺》，有解熱、止瀉、解毒和活血散瘀等功效，曾被收錄于1977年版《中國藥典》。從鬼針草中分離得到活性化合物成分有黃酮類、聚炔類、有機(jī)酸及其酯和揮發(fā)油等，在抗高血壓、抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗炎、保肝護(hù)肝、抗結(jié)石等方面均表現(xiàn)出藥理活性[1-2]。據(jù)報道，鬼針草的水提液可抑制堪薩斯分枝桿菌生長[3]，醇提物則對金黃色葡萄球菌、黑根霉菌、鏈格孢菌及灰葡萄孢菌存在不同程度的抑制作用[4]，表明鬼針草中存在抑菌活性成分。陳飛虎團(tuán)隊篩選發(fā)現(xiàn)鬼針草總黃酮為其有效部位[5]，目前關(guān)于鬼針草有效部位抗菌活性的研究較少，本研究評價小花鬼針草總黃酮部位的抗菌活性，為鬼針草黃酮類成分的研究與開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津UV-3010型紫外分光光度計，52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），METTLERAE 240型電子分析天平（瑞士梅特勒公司），DK-8244電熱恒溫水浴鍋（江蘇常州國華電器有限公司），BSP-250生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）等。

1.2 實驗藥品 干燥小花鬼針草藥材經(jīng)山東中醫(yī)制藥系周長征老師鑒定為小花鬼針草（Bidens parviflora willd.）。

1.3 實驗菌種 黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌由某醫(yī)院提供，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.4 試劑與試藥 95%乙醇、乙醇購自山東省禹王化工分公司，石油醚、乙酸乙酯、M-H培養(yǎng)基、瓊脂購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。蒸餾水為自制，水為杭州娃哈哈純凈水，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物藥品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 小花鬼針草總黃酮制備 參照文獻(xiàn)[4-6]標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.1 提取 取干燥小花鬼針草適量，粉碎后稱取20 g置圓底燒瓶中，加入50%乙醇200 mL加熱回流1 h后濾過，再加入50%乙醇200 mL加熱回流1 h，合并濾液；以石油醚萃取至石油醚層無色，棄去石油醚層；再加乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯部位65℃減壓濃縮至10 mL。

2.1.2 精制 以大孔樹脂AB-8柱層析分離，蒸餾水洗脫至無色，70%乙醇洗脫300 mL，收集有黃酮顏色反應(yīng)的洗脫液，濃縮后真空干燥即得。

2.1.3 含量測定 依據(jù)2015年版《中國藥典》山楂葉中總黃酮含量的測定方法，以蘆丁為對照品，用紫外-可見分光光度法測定小花鬼針草總黃酮的含量。

2.1.3.1 線性關(guān)系考察 測定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在510 nm波長處的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=3.035 9X+0.007 4（r2=0.999 9）。結(jié)果表明，蘆丁檢測濃度在0.0261 6～0.130 80 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.3.2 樣品含量測定 精密稱定總黃酮樣品10 mg，平行5次測定，結(jié)果見表1，樣品中平均黃酮含量為74.76%。

表1 鬼針草總黃酮部位中的黃酮含量測定結(jié)果（以蘆丁計）

2.2 小花鬼針草總黃酮抑菌實驗

2.2.1 K－B紙片藥敏實驗

2.2.1.1 菌液配制 將4種菌分別接種于瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似菌落5～6個，接種于10 mL的 M－H培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h；用生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)?比濁標(biāo)準(zhǔn)，即含1×108CFU/mL的菌懸液。

2.2.1.2 紙片制備 精密稱取總黃酮樣品10 mg至100mL容量瓶，以75%乙醇溶解并以蒸餾水定容，搖勻，取該溶液適量分別以蒸餾水稀釋成濃度為10、30、50、70、100μg/mL的總黃酮溶液；將空白藥敏紙片（6 m m）分別置于西林瓶（蒸餾水清洗后高熱滅菌，備用）中（1片/瓶），分別加入不同濃度溶液1 mL，均勻吸收后置于37℃恒溫箱內(nèi)干燥。

2.2.1.3 平板接種 分別取上述菌株的新鮮培養(yǎng)物，用涂布棒蘸取適量菌液均勻涂布于整個培養(yǎng)基表面。將含有藥樣的藥敏紙片濾水，微干后鋪于平板表面，置37℃恒溫箱孵育18～24 h。

2.2.1.4 抑菌環(huán)直徑測量 培養(yǎng)結(jié)束取出平板，測定抑菌環(huán)直徑并記錄。每個樣品平行3次測定，取抑菌環(huán)直徑平均值，結(jié)果見表2。

2.2.2 小花鬼針草總黃酮的最低抑菌濃度（MIC）測定 采用倍比稀釋法，取試管編號1～8，1號管裝1.8 mL液體培養(yǎng)基，2～8號管裝液體培養(yǎng)基1 mL。高壓滅菌后冷卻，無菌操作下，在1號管加入濃度為1 mg/mL的鬼針草總黃酮溶液0.2 mL，搖勻后，從1號試管吸取1 mL混合液移入2號管，依次操作后，1～7號管中，鬼針草提取物濃度依次為100、50、25、2.5、6.25、3.125、1.56 μg/mL。到 8 號管棄去1 mL，8號管作對照管。1～8號試管各加入菌懸液0.1 mL，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察對照試管混濁（+，有細(xì)菌顯著生長），判定澄清（－，無肉眼可見菌生長）試驗管的最低濃度為鬼針草對該菌的MIC，結(jié)果見表3。

表2 不同劑量小花鬼針草總黃酮對4種細(xì)菌抑菌環(huán)直徑統(tǒng)計結(jié)果 μg/片

表3 小花鬼針草總黃酮的最低抑菌濃度

3 小結(jié)與討論

植物源抗菌物質(zhì)在自然界中廣泛存在，植物體內(nèi)的許多次生代謝產(chǎn)物如生物堿、黃酮類、有機(jī)酸類和酚類化合物等存在殺菌活性[7－8]，研究表明植物源黃酮類物質(zhì)具有廣譜抑菌性[9－10]。本實驗研究了小花鬼針草乙酸乙酯部位總黃酮對金黃色葡萄球菌等4種菌的抗菌作用，結(jié)果顯示對大腸桿菌幾乎無抑菌作用，對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。與文獻(xiàn)報道鬼針草醇提取物在體外對金黃色葡萄球菌和真菌有抑制作用[11－13]一致，提示總黃酮為鬼針草抗菌的有效部位?？傸S酮部位對多種菌表現(xiàn)出抑制作用，可能有較廣的抗菌譜。

目前已從鬼針草總黃酮中分離出許多單體成分，如 2（R/S）－異奧卡寧－（3′，4′－二甲醚）－7－O－β－D－葡萄糖苷、（Z）－6－O－（6′－O－乙?；拢璂－吡喃葡萄糖基）－6，7，3′，4′－四羥基橙酮、海生菊苷、異槲皮苷等，并研究各單體成分的抗肝纖維化、抗氧化等藥理作用[9－11]，但幾乎沒有對單體成分的抗菌研究，下一步將篩選乙酸乙酯部位黃酮中的抗菌單體成分，深入探討其單體活性成分的抑菌機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系。本研究為小花鬼針草黃酮部位抗菌作用的深入研究，及作為新型天然植物源防腐劑的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)，促進(jìn)鬼針草資源更合理的利用。

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