沈 鑫，夏玉坤，張瑩雯，周 珍，艾 望，張 朋

甲狀腺髓樣癌（MTC）是一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，來(lái)源于甲狀腺濾泡C細(xì)胞，侵襲性強(qiáng)，早期易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移[1]。近二十年來(lái)，MTC的發(fā)病率急劇升高[2－3]，其發(fā)病率約占全部甲狀腺惡性腫瘤的3%～5%，病死率高達(dá)13.4%[4]。手術(shù)切除是治愈MTC的唯一手段，但對(duì)于手術(shù)無(wú)法完全切除或術(shù)后復(fù)發(fā)及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，由于MTC對(duì)放射性I131，促甲狀腺激素及化療不敏感，目前尚無(wú)令人滿意的治療方法[5]。因此，尋找治療MTC更有效的藥物是臨床治療迫切需要解決的問(wèn)題。

開(kāi)口箭是一種中草藥，為百合科鈴蘭族開(kāi)口箭屬植物，味苦辛、性寒，具有清熱解毒、散瘀止痛的功效[6]，可治療咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、毒蛇咬傷。開(kāi)口箭提取物的主要活性成分為皂苷，開(kāi)口箭總皂苷（TST）對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞、人胃癌BGC－823細(xì)胞、人肺腺癌H1299細(xì)胞、人肝癌SMMC－7721、HepG2細(xì)胞、人乳腺癌MCF－7細(xì)胞和直腸癌SW480細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[7－10]。實(shí)驗(yàn)將通過(guò)觀察TST對(duì)MTC－TT細(xì)胞增殖的抑制作用及Notch 1信號(hào)的影響，進(jìn)一步探討TST抗MTC機(jī)制，為臨床治療提供新思路。

1 材料

1.1 主要試劑與藥物 MTC－TT細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，開(kāi)口箭購(gòu)于武漢大學(xué)中南醫(yī)院中藥房，胎牛血清（杭州四季青公司，批號(hào)141215），F(xiàn)12k培養(yǎng)基（HyClone公司，批號(hào) SH30023），胰酶溶液（吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，批號(hào)GNM25200），細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（天津三箭生物技術(shù)有限公司，批號(hào)CY2001－O），CCK8檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，型號(hào)C0038），三氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑，批號(hào) 10006818），PrimeScript?RTreagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa公司，批號(hào)RR047A）、SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（TaKaRa公司，批號(hào)RR420A），SDS－PAGE凝膠制備試劑盒（ASPEN公司，批號(hào)AS1012）、RIPA總蛋白裂解液（ASPEN公司，批號(hào)AS1004）、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（ASPEN公司，批號(hào)AS1086）。

1.2 主要儀器 倒置相差顯微鏡（Olympus公司，型號(hào)IX51），紫外分光光度計(jì)（PerkinElmer公司，型號(hào)Lambda 45），酶標(biāo)儀（Diatek公司，型號(hào)DR-200Bs），PCR 儀（杭州博日科技，型號(hào) TC-XP），制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司，型號(hào)IMS-20），電泳儀（北京市六一儀器廠，型號(hào)DYY-6C），流式細(xì)胞儀（BD公司，型號(hào)FACSCalibur），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI公司，型號(hào) R-210）。

2 方法

2.1 TST的制備

2.1.1 TST提取 取開(kāi)口箭干燥根莖1 kg，3L 75%乙醇加熱回流提取2 h，反復(fù)提取3次。合并提取液，減壓蒸餾，得到浸膏加1 L水溶解，置于分液漏斗，500 mL石油醚萃取3次。水溶液用500 mL水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇溶液減壓蒸餾，得總皂苷粗品A，水相減壓蒸餾得總皂苷粗品B。HPD-100大孔樹(shù)脂柱層析，總皂苷粗品A依次用3 L 20%乙醇洗脫，10 L 40%乙醇洗脫，最后以10 L 70%乙醇洗脫，收集70%部位。減壓濃縮，干燥后呈粉末狀，即為開(kāi)口箭總皂苷，稱質(zhì)量6.16 g。

2.1.2 TST成分及性質(zhì)檢測(cè) 泡沫實(shí)驗(yàn)及三氯醋酸反應(yīng)實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，確認(rèn)為甾體皂苷。將適量樣品溶解于甲醇中，定容至1 mg/mL濃度。取200μL溶液，60℃揮干溶劑，加入200μL 5%香草醛-冰乙酸溶液和800μL高氯酸，搖勻，60℃恒溫水浴加熱20 min，冰浴冷卻15 min，加入5 mL冰醋酸，搖勻，測(cè)定458nm波長(zhǎng)處吸光值。TST含量（%）=（W/0.2）×100%={[0.0631+0.2835（Ai-Ac）]/0.2}×100%。W：皂苷含量（mg）；Ai：樣品平均吸光度，Ac：空白對(duì)照平均吸光度?？瞻讓?duì)照樣品平均吸光度為0.066 6，70%部位樣品平均吸光度為0.610 8。70%部位總皂苷含量為77.13%。

2.1.3 開(kāi)口箭溶液的配制 用含20%滅活新生小牛血清（FBS）的F12K培養(yǎng)液配制成2 000μg/mL的溶液，其余濃度按需稀釋配制，0.22μm的微孔濾過(guò)膜過(guò)濾除菌備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) MTC-TT細(xì)胞復(fù)蘇后用培養(yǎng)基（F12k培養(yǎng)基+20%胎牛血清+1%雙抗）培養(yǎng)細(xì)胞，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）消化傳代。

2.3 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞的抑制作用及對(duì)Notch1的影響

2.3.1 CCK8法檢測(cè)TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞增殖抑制率影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MTC-TT細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，過(guò)夜培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁。24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入含 2、4、8、16、32 μg/mL 的 TST，對(duì)照組只加細(xì)胞不給藥，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，取出培養(yǎng)板于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，吸棄培養(yǎng)基，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)向每孔加入10μL CCK8溶液，37℃孵育4 h，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定每孔吸光度（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對(duì)照組OD值×100%，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以時(shí)間為橫軸、抑制率為縱軸，繪制各組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算IC50值。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)CCK8結(jié)果，選取最小IC50值，實(shí)驗(yàn)分為4組，對(duì)照組（對(duì)照組，培養(yǎng)基中無(wú)藥物）,TST低濃度組（TL，0.5倍 IC50），TST中濃度組（TM，IC50）和 TST 高濃度組（TH，2倍 IC50）。

2.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MTC-TT細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MTC-TT細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度TST，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，處理48h，胰酶消化后以1000r/min離心5min收集細(xì)胞，棄上清，收集細(xì)胞，沉淀中緩慢加入預(yù)冷的90%乙醇，重懸細(xì)胞，4℃孵育20min，1000r/min離心5min收集細(xì)胞，用3 mLPBS重懸細(xì)胞，300 g離心5 min。加入500μL碘化丙啶PI染液重懸細(xì)胞，避光染色20 min，上機(jī)檢測(cè)。

2.3.4 RT-PCR檢測(cè)Notch1mRNA的表達(dá)水平 按實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度TST，對(duì)照組加入等體積培養(yǎng)基，處理48 h。采用Trizol一步法提取總RNA,第一鏈cDNA的合成采用PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNAEraser進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 1 min，循環(huán) 40次（95℃，15 s→58℃，20 s→72℃，45 s），熔解曲線（60℃→95℃，每 20 s升溫1℃）。目的基因擴(kuò)增用ΔΔCT法計(jì)算，A=CT（目的基因，實(shí)驗(yàn)樣本）－CT（內(nèi)標(biāo)基因，實(shí)驗(yàn)樣本），B＝CT（目的基因，對(duì)照樣本）－CT（內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本），K＝A－B，表達(dá)倍數(shù)＝2－K。引物序列由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成，見(jiàn)表1。

2.3.5 Western blot檢測(cè)Notch 1蛋白的表達(dá) 收集不同濃度TST處理48 h的實(shí)驗(yàn)組處理細(xì)胞和培養(yǎng)基處理48 h的對(duì)照組細(xì)胞裂解提取蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，以SDS-PAGE分離膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液室溫封閉1 h，加入已稀釋好的一抗4℃過(guò)夜，回收已稀釋的一抗，用TBST洗3次，每次5 min，加入稀釋好的二抗，室溫孵育30 min，用TBST在室溫下?lián)u床上洗4次，每次5 min，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，AlphaEaseFC4.0軟件處理目標(biāo)帶的光密度值。

表1 引物序列

2.4 DAPT（Notch1抑制劑）對(duì)MTC-TT細(xì)胞的抑制作用及對(duì)Notch 1蛋白表達(dá)的影響

2.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（培養(yǎng)基中無(wú)藥物）、TST 組（IC50）、TST（IC50）+DAPT（4.32 μg/mL）組和DAPT組（4.32μg/mL）。

2.4.2 CCK8檢測(cè)DAPT（Notch1抑制劑）對(duì)MTCTT細(xì)胞增殖抑制率影響 采用CCK8法觀察陰性對(duì)照組、TST組、TST+DAPT組和DAPT組作用于MTC-TT細(xì)胞48 h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率。

2.4.3 Western blot檢測(cè)DAPT對(duì)Notch 1蛋白表達(dá)的影響 采用Western bolt法檢測(cè)陰性對(duì)照組、TST組、TST+DAPT組和DAPT組作用于MTC-TT細(xì)胞48 h時(shí)細(xì)胞Notch1蛋白的表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞增殖的影響 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞增殖具有抑制作用，具有時(shí)間—濃度依賴性，見(jiàn)圖1。TST作用于MTC-TT細(xì)胞24、48和72 h的IC50值分別為59.01、31.54和31.63μg/mL。

3.2 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞周期的作用 對(duì)照組細(xì)胞大多處于G0/G1期，經(jīng)不同濃度TST作用48 h后，MTC-TT細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變。相比于對(duì)照組，TST中濃度組和TST高濃度組G0/G1期細(xì)胞相對(duì)減少（P<0.05或 P<0.01），TL、TM、TH 濃度組 G2/M 期細(xì)胞增加（P<0.05或P<0.01），細(xì)胞阻滯在G2/M期。見(jiàn)表 2、圖 2。

圖1 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞增殖的影響

表2 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞周期的作用（x±s）%

3.3 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞Notch1的mRNA表達(dá)影響 TST低濃度、中濃度、高濃度組Notch1表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P<0.01），TST高濃度組Notch1表達(dá)水平最高，Notch1表達(dá)呈濃度依賴性，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表3。

3.4 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞 Notch1的蛋白表達(dá)影響 TST低濃度、中濃度、高濃度組Notch1蛋白的表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P<0.05或P<0.01），TST高濃度組Notch1表達(dá)水平最高，Notch1表達(dá)呈劑量依賴性，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表 4、圖 3。

圖2 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞周期的影響

表3 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞Notch1 mRNA表達(dá)影響（x±s）

表4 TST對(duì)MTC-TT細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)影響（x±s）

圖3 TST作用于MTC-TT細(xì)胞的Western blot電泳圖

3.5 DAPT對(duì)MTC－TT細(xì)胞增殖的影響 相比于陰性對(duì)照組，TST組和TST+DAPT組抑制率顯著升高（P＜0.01），DAPT組抑制率與之相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；TST組抑制率高于TST+DAPT組和DAPT組，組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DAPT組抑制率低于 TST 與TST+DAPT 組（P＜0.01），見(jiàn)表 5。

表5 DAPT對(duì)MTC-TT細(xì)胞增殖的影響（x±s）

3.6 DAPT對(duì)MTC－TT細(xì)胞Notch1表達(dá)的影響 陰性對(duì)照組中有少量Notch1蛋白表達(dá)，與陰性對(duì)照組相比，TST組Notch1表達(dá)顯著升高（P＜0.01），TST+DAPT組Notch1表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），DAPT 組 Notch1表達(dá)下降（P＜0.01）；與TST組相比，TST+DAPT組Notch1表達(dá)顯著下降（P<0.01）；DAPT組的Notch1表達(dá)均低于其余 3組（P<0.01），見(jiàn)表 6、圖 4。

表6 DAPT對(duì)MTC-TT細(xì)胞Notch1蛋白表達(dá)影響（x±s）

圖4 DAPT作用于MTC-TT細(xì)胞的Western blot電泳圖

4 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，Notch1既是致癌基因，也是抑癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，包括結(jié)腸癌、卵巢癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等，在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（NETs）中表達(dá)很低或者缺失[11－12]。由于甲狀腺C細(xì)胞在胚胎學(xué)上系自神經(jīng)嵴組織演化發(fā)育而來(lái)，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，所以MTC是一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，Notch1在MTC中表現(xiàn)為抑癌基因作用。Kunnimalaiyaan等[13]發(fā)現(xiàn)人甲狀腺髓樣癌組織和MTC－TT細(xì)胞中，Notch1處于失活狀態(tài)時(shí)，NE腫瘤標(biāo)志物ASCL1、CgA、降鈣素均表達(dá)較高；強(qiáng)力霉素激活Notch1后，ASCL1表達(dá)水平明顯下降，進(jìn)而CgA、降鈣素表達(dá)水平均下降；Notch1還可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白P21將細(xì)胞抑制在G1/S期，抑制細(xì)胞增殖。因此，激活Notch 1信號(hào)蛋白，可能是臨床治療MTC的新方法。

實(shí)驗(yàn)中，TST可呈劑量依賴性抑制MTC－TT細(xì)胞生長(zhǎng)，并可使G0/G1期細(xì)胞相對(duì)減少，G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，實(shí)驗(yàn)表明TST可使細(xì)胞阻滯于G2/M期，通過(guò)有絲分裂干擾細(xì)胞進(jìn)程，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。MTC－TT細(xì)胞中有少量Notch 1表達(dá)，經(jīng)不同濃度TST處理后，Notch 1的蛋白和基因表達(dá)均明顯升高，且呈劑量依賴性，表明TST可上調(diào)Notch 1表達(dá)；為進(jìn)一步驗(yàn)證TST通過(guò)調(diào)控Notch 1分子發(fā)揮抑制MTC-TT細(xì)胞的作用，將TST與Notch1抑制劑DAPT共同作用于MTC-TT細(xì)胞，CCK8結(jié)果示TST+DAPT組抑制率明顯低于DAPT組，驗(yàn)證了TST通過(guò)Notch1發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖作用。TST+DAPT組相比于對(duì)照組，仍具有一定的抑制作用，提示TST可能還通過(guò)其他通路發(fā)揮抑制MTC-TT細(xì)胞作用，還需進(jìn)一步研究。結(jié)果表明開(kāi)口箭可抑制MTC-TT細(xì)胞增殖，干擾細(xì)胞周期，其抑制作用與上調(diào)Notch1表達(dá)有關(guān)。

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