超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定肉類中的6種糖皮質(zhì)激素

王 躍

（哈爾濱市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，黑龍江哈爾濱 150001）

0 引言

糖皮質(zhì)激素，又名“腎上腺皮質(zhì)激素”，是腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素，也可由化學(xué)方法人工合成，不僅具有抗菌消炎的作用，還具有調(diào)節(jié)糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝作用。近年來，糖皮質(zhì)激素在獸醫(yī)臨床上被廣泛應(yīng)用，并且臨床用藥量逐年增加，而其毒副作用常被忽視，濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重，長(zhǎng)期大量使用會(huì)引起物質(zhì)代謝紊亂和水鹽代謝紊亂，出現(xiàn)類腎上腺皮質(zhì)功能亢進(jìn)綜合征[1-3]。長(zhǎng)期食用獸藥殘留的食品，會(huì)造成獸藥在體內(nèi)蓄積，當(dāng)其濃度達(dá)到一定量時(shí)，會(huì)擾亂體內(nèi)激素分泌、降低機(jī)體免疫力，造成肌肉萎縮無力、骨質(zhì)疏松和生長(zhǎng)遲緩等直接危害，而且還會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、軟弱無力、精神沉郁、食欲不振，血糖和血壓下降等急性或慢性中毒癥狀[4-9]。因此建立有效、快速的方法檢測(cè)禽畜肉類中的糖皮質(zhì)激素的殘留具有重大意義。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器

T-QS型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品；XS-105型電子分析天平，瑞士梅特勒公司產(chǎn)品；XH-B型渦旋混合機(jī)，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品；HSC-12B型氮吹儀，天津恒奧科技公司產(chǎn)品；P-12型平行蒸發(fā)儀，瑞士步琦公司產(chǎn)品；固相萃取裝置，美國(guó)安捷倫科技公司產(chǎn)品；KQ-100DE型超聲清洗機(jī)，湖北生化科技設(shè)備公司產(chǎn)品；TG16-WS型離心機(jī)，湖北湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；固相萃取柱，美國(guó)沃特世公司產(chǎn)品。

1.2 對(duì)照品及試劑試藥

曲安西龍（批號(hào)100333-200201）、氫化可的松（批號(hào) 100152-200206）、地塞米松 （批號(hào) 100129-200804）、潑尼松（批號(hào)100199-201002）、潑尼松龍（批號(hào)100153-201004）、倍他米松（批號(hào)100118-200403），中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；正己烷、丙酮、乙腈為質(zhì)譜純，德國(guó)Merck公司提供；水為超純水，屈臣氏公司提供。

1.3 樣品的制備

（1） 提取。稱取樣品2 g置50 mL離心管中，加入乙酸乙酯10 mL，渦旋提取3 min，然后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心10 min，取全部上清液。重復(fù)上述提取1次，合并乙酸乙酯層，于45℃下平行蒸發(fā)至近干。用乙酸乙酯-正己烷（1∶5）溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

（2）凈化。取待凈化液過柱，用5 mL正己烷淋洗固相萃取柱，抽干，用正己烷-丙酮6/4洗脫，45℃氮?dú)獯蹈桑贸跏继荻攘鲃?dòng)相1 mL溶解，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取6種糖皮質(zhì)激素分別配制成質(zhì)量濃度為10，20，50，100，200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。分別以每種物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.40 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量5 μL。

流動(dòng)相A：5 mmol/L甲酸銨；流動(dòng)相B：乙腈。

6種糖皮質(zhì)激素分離的流動(dòng)相梯度見表1。

表1 6種糖皮質(zhì)激素分離的流動(dòng)相梯度

1.6 質(zhì)譜條件

電噴霧電離元（ESI）、負(fù)離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM） 模式、毛細(xì)管電壓3.00 kV；錐孔電壓30 V；脫溶劑氣體溫度350℃；脫溶劑氣體流量700 L/Hr；錐孔氣體流速150 L/Hr，在分析過程中以子母離子的保留時(shí)間和豐度比定性，以峰面積定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物的優(yōu)化

糖皮質(zhì)激素在電噴霧質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰有[M+H+]、[M-H-]、[M+HCOO-]等多種形式。試驗(yàn)采用50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。分別在正離子（ESI+）和負(fù)離子（ESI-）模式下進(jìn)行全掃描，結(jié)果表明6種物質(zhì)在[M+HCOO-]模式下均具有較高的響應(yīng)，因此選用負(fù)離子掃描方式，分別對(duì)6種物質(zhì)進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定待測(cè)化合物的準(zhǔn)分子離子峰，并分別優(yōu)化錐孔電壓，通過氬氣碰撞產(chǎn)生子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化碰撞能量，選擇豐度較高的碎片離子作為定性與定量特征離子。

6種糖皮質(zhì)激素質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 6種糖皮質(zhì)激素質(zhì)譜參數(shù)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)下，因此流動(dòng)相的組成會(huì)影響目標(biāo)物的保留時(shí)間和峰型。當(dāng)采用甲醇作為有機(jī)流動(dòng)相時(shí)，倍他米松的響應(yīng)值大大降低，且峰形拖尾，而選用酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，在負(fù)離子模式下會(huì)抑制電離，因此選用甲酸銨和已經(jīng)作為流動(dòng)相。采用不同比例的流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫時(shí)，6種組分的靈敏度不理想，因此選用梯度洗脫。在梯度洗脫過程中，選擇含有90%的水相到含有90%的有機(jī)相的快速切換，有助于化合物快速洗脫，減少色譜峰的拖尾現(xiàn)象。

6種糖皮質(zhì)激素分離色譜見圖1。

圖1 6種糖皮質(zhì)激素分離色譜

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性關(guān)系

采用優(yōu)化后的色譜條件和質(zhì)譜條件測(cè)得的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別以每種物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在10～200 ng/mL的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

6種糖皮質(zhì)激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍見表3。

表3 6種糖皮質(zhì)激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.3.2 回收率、精密度及檢出限

用空白基質(zhì)加標(biāo)樣來計(jì)算6種糖皮質(zhì)激素的回收率，共設(shè)置3個(gè)質(zhì)量濃度梯度10，50，200 ng/mL，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)平均偏差反應(yīng)結(jié)果的精密度。用10 ng/mL試樣進(jìn)樣分析，計(jì)算6種物質(zhì)的信噪比，分別按照S/N=3和S/N=10時(shí)6種糖皮質(zhì)激素的濃度，確定檢出限及定量限。結(jié)果見表4，可知該方法具有較高的靈敏度和較低的檢出限。

6種糖皮質(zhì)激素的回收率、檢出限及定量限見表4。

表4 6種糖皮質(zhì)激素的回收率、檢出限及定量限

3 結(jié)論

建立了肉類中的6種糖皮質(zhì)激素測(cè)定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法，對(duì)市售的數(shù)10種禽畜類肉進(jìn)行了測(cè)定，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有簡(jiǎn)單快捷、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，而且能夠快速實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的色譜分離，可快速檢測(cè)肉類中的6種糖皮質(zhì)激素，同時(shí)它將快速定性篩查和定量分析結(jié)合為一體，既能縮短檢測(cè)時(shí)間，又能節(jié)約人力成本，提高工作效率。

[1]羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等.固相萃取/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定面膜類化妝品中非法添加的53種糖皮質(zhì)激素 [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2016，35（2）：119-126.

[2]Yamashita K， Takahashi M， Tsukamoto， et al.Fast seperation and sensitive detection of carcinogenic aromatic amine by reversed-phase-liquid chromatography coupled with electrochemical detection[J].Journal of Chromatography A，2007（1/2）：120-128.

[3]安瑜，王慧蕓，張敏娟，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)法液態(tài)乳及原料乳中舒巴坦 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2010（12）：52-54，60.

[4]Delahaut P，Jacquemin P，Colemonts Y，et al.A rapid and highly sensitive method for the quantitative determination of dexamethasone in plasma，synovial fluid and tissues by combined gas chromatography/negative ion chemical ionization mass spectrometry[J].Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications 2007 （26）：203-215.

[5]Mollmann H，Rohdewald P，Barth J，et al.Bioavailability of dexamethasone；II.Dexamethasone phosphate[J].Pharmaceutical research，1988 （4）：509-513.

[6]Shibata N，Hayakawa T，Takada K，et al.Chromatography with precolumn fluorimetric derivatization by 9-anthroyl nitrile[J].Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications，1998 （2）：191-199.

[7]Bagnati R，Ramazza V，Zucchi M，et al.A new class of fungal steroid transformation product[J].Analytical biochemistry，2008，31 （20）：119-126.

[8]樊雯娟，代立勤，劉新智.高效液相色譜-柱后衍生法檢測(cè)牛奶中10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留 [J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2016（2）：29-31，34.

[9]崔曉亮，邵兵，趙榕，等.超高效液相色譜串聯(lián)電噴霧四級(jí)桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中12種糖皮質(zhì)激素的殘留[J].色譜，2006，24（3）：213-217.◇