韓如月，楊 帆，李睿瑞，劉淑霞，張千豐，王麗艷，郭永霞

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶 163319；3.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣東深圳 518000）

木醋液（Wood vinegar）是由木材、木屑、樹枝、樹葉、秸稈等一些農(nóng)林廢棄物熱解碳化的過程中產(chǎn)生的氣體，經(jīng)過冷凝回收再分離得到的有機液體。其主要成分比較復雜，主要成分為酸類、醛類、酮類和酚類，還有酯類、醇類、胺類、吡啶，以及K，Ca，F(xiàn)e，Mg，Zn，Mn，Ge 等微量元素[1]。因其不產(chǎn)生二次污染[2]，材料隨處可見，可變廢為寶，而且都是可再生資源，成本低廉、加工方法簡單、節(jié)約能源，經(jīng)濟效益可觀[3]。木醋液在促進作物生長、土壤改良、防蟲抑菌和果蔬保鮮等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域均有很好的研究進展[4]。有關(guān)研究表明，從蘋果樹干和蘋果葉中制得的木醋液具有抗氧化作用。皮膚保健和豬飼料[5-7]等方面也有涉及。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，日本農(nóng)民普遍使用木醋液防治作物、果樹病害和土傳病害，效果明顯[8-10]，也可作為保鮮劑使用[11-12]。木醋液的研究與開發(fā)將對國家經(jīng)濟、能源、環(huán)保等方面的發(fā)展起促進作用，具有極大的發(fā)展前景[13]。

由于木醋液來自于農(nóng)林廢棄物炭化的副產(chǎn)品，是天然無害的植物源農(nóng)藥，具有不污染環(huán)境、對人畜安全、特異性高、防效好、安全無害、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，國內(nèi)利用木醋液抑制植物病原菌的應(yīng)用較少，也沒有與農(nóng)藥復配使用的報道，故試驗以木醋液為天然抑菌劑，通過測定菌落直徑、最低抑菌濃度和真菌的抑菌圈大小，研究木醋液對植物病原真菌的抑菌效果，通過與化學農(nóng)藥復配，研究了木醋液對植物病原菌的抑菌效果，篩選出與農(nóng)藥混合的最佳配伍，為木醋液在抑菌方面的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 試驗材料與設(shè)備

1.1 試劑與培養(yǎng)基

木醋液（能邇木醋液），購自當?shù)厥袌?；農(nóng)藥惡霉靈，威海韓浮生化藥業(yè)有限公司提供；1%和1.5%PDA培養(yǎng)基。

1.2 供試菌株

供試菌株，黑龍江八一農(nóng)墾大學農(nóng)學院植物病理實驗室提供。具體如下：

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、半裸鐮刀菌（Fusarium graminearum）、禾谷鐮刀菌 （Fusarium graminearum Schw）、串珠鐮刀菌 （Fusarium verticillioides）、茄鏈格孢菌（Alternaria solani）、玉米鏈格孢菌 （Alternaria tenuis Nees）、玉米新月彎孢菌（Curvularia lunata）、立枯絲核菌 （Rhizoctonia solanikuhn）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bar）、稻瘟病菌（Magnapporthe grisea）、甜瓜枯萎病菌（F.oxysprum f.sp.melonis）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、禾頂囊殼菌（Gaeumannomyces graminis）。

1.3 主要儀器

超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、牛津杯、鑷子、打孔器、接種針、滅菌鍋等。

2 試驗方法

2.1 木醋液與植物病原菌的對峙試驗

2.1.1 不同體積濃度木醋液的制備

木醋液濃度為 1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5μL/mL的制備：取5個1.5mL離心管中依次加入900 μL無菌水，往第1個離心管中加入100 μL木醋液原液，混勻后再從第1個離心管中取100 μL加入第2個離心管中，以此類推直至第5個離心管，此時木醋液濃度依次為0，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5μL/mL。

2.1.2 不同體積濃度木醋液的抑菌試驗

（1） 雙層平板的制備。向直徑90 mm培養(yǎng)皿中先倒入1.5%固體PDA培養(yǎng)基5 mL，凝固后再倒入1%固體PDA培養(yǎng)基15 mL，待其凝固。

（2） 牛津杯法（也稱管碟法）。用5 mm打孔器在真菌邊緣打好菌碟，用接種針挑到雙層平板中央處，置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待真菌的菌絲長至半徑約為1.5 cm時，用鑷子在菌碟周圍半徑約為3.5 cm處均勻放置滅菌的牛津杯，輕輕按壓但不要戳破培養(yǎng)基，再吸取不同濃度木醋液各200 μL順時針加入牛津杯的濃度分別為0，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5μL/mL，做 3 次重復。菌碟周圍不加牛津杯為對照組1，菌碟周圍加牛津杯不加木醋液為對照組2。置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對照組菌絲半徑長到3.5 cm時，觀察并測量抑菌圈大小。

抑菌圈半徑=對照組菌絲半徑-抑菌邊緣半徑.

計算各處理對菌絲生長的抑制率：

試驗中使用的所有儀器均用滅菌鍋121℃滅菌30 min。

2.2 木醋液與農(nóng)藥復配的植物病原菌的對峙試驗

選擇對多種植物病原菌抑制效果最好的1×10-1μL/mL的木醋液與化學農(nóng)藥原藥稀釋3 000倍的惡霉靈進行復配。同2.2中的方法制備雙層平板，待真菌的菌絲長至半徑約為1.5 cm時，用鑷子在菌碟周圍半徑約為3.5 cm處均勻放置滅菌的牛津杯，輕輕按壓但不要戳破培養(yǎng)基，在雙層平板最上方的牛津杯中加入200 μL的無菌水，順時針依次加入200μL的木醋液與農(nóng)藥，比例依次為10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10，做3次重復。置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對照組菌絲半徑長到3.5cm時，觀察并測量抑菌圈大小。

抑菌圈半徑=照組菌絲半徑-抑菌邊緣半徑.

計算各處理對菌絲生長的抑制率：

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用單因素完全隨機設(shè)計試驗結(jié)果的方差分析利用Duncan's法分析數(shù)據(jù)之間的差異性。

3 結(jié)果與分析

3.1 木醋液對植物病原菌的抑菌效果

不同稀釋倍數(shù)木醋液對植物病原菌的抑制作用見表1。

表1 不同稀釋倍數(shù)木醋液對植物病原菌的抑制作用

從表1可以看出，稀釋10倍的木醋液對立枯絲核菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮刀菌、玉米鏈格孢菌這4種病原菌的抑菌圈較大，且在0.05水平上效果顯著，有較強的抑制作用，對照組2無抑菌圈，說明牛津杯對其無抑制作用；稀釋1 000倍的木醋液對玉米新月彎孢菌的抑菌圈較大，且在0.05水平上效果顯著，有較強的抑制作用，對照組2無抑菌圈，說明牛津杯對其無抑制作用。串珠鐮刀菌和小麥根腐病的每個木醋液濃度都有抑菌圈，而對照組2也存在抑菌圈說明牛津杯對2種病原菌有抑制作用；木醋液對尖孢鐮刀菌、半裸鐮刀菌、茄鏈格孢菌、甜瓜枯萎病、稻瘟病菌、禾頂囊殼菌這6種病原菌無明顯抑菌圈，鐵環(huán)對其也沒有抑制作用。說明木醋液對一些植物病原菌有抑制作用，對一些植物病原菌沒有作用。

部分植物病原菌與不同稀釋倍數(shù)的木醋液的對峙試驗見圖1。

圖1 部分植物病原菌與不同稀釋倍數(shù)的木醋液的對峙試驗

3.2 木醋液與農(nóng)藥復配對植物病原菌的抑菌效果

稀釋10倍的木醋液與稀釋1 000倍的農(nóng)藥惡霉靈，按不同體積比例復配后對立枯絲核菌和大豆菌核病菌的抑菌圈和抑菌率。

木醋液與農(nóng)藥復配對2種植物病原菌的抑制作用見表2。

從表2可以看出，對于立枯絲核菌，木醋液與農(nóng)藥的比例在10∶0時抑菌圈最大，抑菌圈1.7 cm，抑菌率達到最高85%，與其他配比在0.05水平上具有顯著性，其次是比例為3∶7，抑菌圈1.5 cm，抑菌率達到75%，比例為7∶3和5∶5時最小；對于大豆菌核病菌，木醋液與農(nóng)藥的比例在9∶1時抑菌圈最大，抑菌圈1.7 cm，抑菌率達到最高60%，與其他配比在0.05水平上具有顯著性，其次是比例為10∶0和3∶7，抑菌圈為1.1 cm，比例為6∶4和5∶5時最小。綜合以上結(jié)果，不管是立枯絲核菌還是大豆菌核病菌，都能說明抑菌作用中木醋液能夠起到主要作用，也能起到輔助和減少農(nóng)藥用量的作用。

表2 木醋液與農(nóng)藥復配對2種植物病原菌的抑制作用

木醋液與農(nóng)藥復配與2種病原菌的對峙試驗見圖2。

圖2 木醋液與農(nóng)藥復配與2種病原菌的對峙試驗

4 結(jié)論與討論

4.1 木醋液對植物病原菌的抑制作用

目前的研究發(fā)現(xiàn)，木醋液是一種潛在的新型植物抗病肥料，對多種細菌、霉菌和植物病原真菌都有抑制作用[14-22]，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌[14]等細菌，黑曲霉、康氏木霉[14]、總狀毛霉、黑根霉[15]、穿地龍霉菌[16]等霉菌，棉花黃萎病菌以及黃瓜炭疽病菌[17-18]、棉花枯萎病菌[19]、馬鈴薯晚疫病菌[20]、花生網(wǎng)斑病菌和黑斑病菌[21]等多種病原真菌。

李燕等人[22]發(fā)現(xiàn)木醋液質(zhì)量分數(shù)為0.60%時對禾谷鐮刀菌菌絲生長的抑制率達到83.78%[22]，出現(xiàn)這種差異可能是由于木醋液的成分不同，有效抑菌物質(zhì)濃度有所差異導致，不同原料的木醋液對植物病原菌的抑制作用不同[19]。馬良進等人[23]的研究結(jié)果表明，單純竹醋液稀釋液與對照相比均有不同程度的抑菌作用。

盡管人們對木醋液具有廣譜性殺菌作用的觀點已達成共識，但試驗結(jié)果表明木醋液并不是對所有植物病原菌均有抑制作用。不同稀釋倍數(shù)的木醋液對植物病原菌的抑制作用不同，木醋液稀釋10倍，對植物病原菌的抑菌效果最好，對立枯絲核菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮刀菌、玉米鏈格孢菌均有抑制作用，稀釋1 000倍對玉米新月彎孢菌有抑制作用。

4.2 木醋液與惡霉靈復配對植物病原菌的抑制作用

植物真菌病害是近年來嚴重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的微生物病害。目前，防治真菌病害的措施主要還是化學防治，而化學農(nóng)藥的長期使用帶來了一系列的問題，導致的農(nóng)業(yè)面源污染問題[24]。引起農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等問題，如何減少化學農(nóng)藥的副作用，成為當前關(guān)注的熱點問題。

惡霉靈是廣譜性殺菌劑，對多種病原真菌引起的植物病害有較高的防治效果，比如一些土壤真菌、鐮刀菌、根殼菌、絲核菌、腐霉菌、苗腐菌、伏革菌等病原菌。故選擇惡霉靈為農(nóng)藥復配對象，意在代替或減少農(nóng)藥惡霉靈的使用。王獻慧等人[25]也發(fā)現(xiàn)硫磺多菌靈與惡霉靈2種殺菌劑的不同比例混劑對蓮藕腐敗病菌均有抑制作用，其抑菌效果與單劑相比，均表現(xiàn)為增效作用。魏琦等人[26]研究表明，竹醋液對蘋果腐爛菌、蘋果炭疽菌和番茄灰霉菌的抑菌作用較強，竹醋液對咪鮮胺、戊唑醇這2種供試殺菌劑具有增效作用。馬良進等人[23]的研究結(jié)果表明，多菌靈1 000倍稀釋液及多菌靈與竹醋液按照1∶3，1∶1和3∶1混配時，對鐮刀菌菌絲生長的抑制作用最明顯；多菌靈與竹醋液按照1∶3，1∶1和3∶1混配時對絲核菌的抑菌效果最好，均達到極顯著差異。同樣木醋液與惡霉靈復配也有相同作用，而且木醋液屬于植物源農(nóng)藥，與化學農(nóng)藥相比之下無污染，不會產(chǎn)生抗藥性，是更好的化學農(nóng)藥替代物。研究表明，木醋液與惡霉靈復配比單獨使用惡霉靈效果好，對其有增效作用，可以減少化學殺菌劑的用量，從而降低化學殺菌劑對食品及環(huán)境安全的不良影響。然而，該結(jié)果是基于室內(nèi)離體活性測定而得出的結(jié)論，在活體或田間條件下，木醋液是否也具有增效作用，尚待進一步研究。

市面上的不同品牌木醋液效果不同，將市場購買的能邇木醋液與黑森木醋液同時做抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，能邇木醋液比黑森木醋液的效果好。初步研究了木醋液離體抑菌機理，發(fā)現(xiàn)木醋液中的酸性成分對其離體抑菌活性具有重要作用，稀釋10倍的能邇木醋液pH值可達3.8，與同pH值的冰醋酸同時做抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，雖然均有抑菌效果，但是能邇木醋液比同pH值的冰醋酸的效果好，故若想將木醋液應(yīng)用于實際生產(chǎn)中還需綜合考慮。

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