張俊志，張中軍，趙 雷，蔡興濤，李 瑩，崔媛媛

(深圳市人民醫(yī)院·暨南大學(xué)第二臨床學(xué)院 麻醉科，廣東 深圳518020)

肺泡上皮細(xì)胞的主要功能是維持肺泡液體的動態(tài)平衡，促進肺泡多余液體的清除，從而提供最佳的氣體交換功能[1]。然而，在急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)過程中，肺泡-毛細(xì)血管屏障受損，使得肺泡液體增多，并造成肺泡液體清除功能下降，導(dǎo)致嚴(yán)重的氣體交換障礙[2]。鈉離子在肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運促使了肺泡液的轉(zhuǎn)運，是肺水腫液清除的主要驅(qū)動力[3]。肺泡上皮鈉離子通道(ENaC)分布于細(xì)胞膜頂端，由3種亞型(α、β、γ)構(gòu)成，調(diào)控鈉離子的轉(zhuǎn)運，在肺泡水腫液體的清除過程中發(fā)揮重要作用[4]。

本研究選擇3種急性肺損傷實驗?zāi)Ｐ图粗嗵?LPS)誘導(dǎo)、鹽酸(HCl)誘導(dǎo)和機械通氣(VILI)引起的肺損傷，對鈉離子通道(ENaC)3種亞型(α、β、γ)的作用，從而反映不同急性肺損傷的共同潛在原因，為促進肺泡水腫液清除和治療肺損傷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

40只雄性SD大鼠由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供；脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；小動物呼吸機(型號R407)購自中國瑞沃德公司；總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；qRT-PCR試劑盒購自美國Thermofisher Scientific公司；Western blot檢測試劑盒購自美國Upstate Biotechnology公司。

1.2 實驗動物分組及急性肺損傷模型制作

清潔級雄性 SD 大鼠 40只，體質(zhì)量 220-240 g，隨機分為4組(n=10)。對照組(Control組)于氣管內(nèi)滴注2 ml/kg生理鹽水，24 h后處死；脂多糖誘導(dǎo)組(LPS組，n=10)氣管內(nèi)滴注5 mg/kg 脂多糖，24 h后處死；鹽酸誘導(dǎo)組(HCL組，n=10)氣管內(nèi)滴注2 ml/kg鹽酸(pH=1.8)，24 h后處死；機械通氣組(VILI組，n=10)采用小動物呼吸機，使用25 ml/kg的高潮氣量和50次呼吸/分鐘的呼吸率對大鼠進行通氣，機械通氣4 h后將大鼠處死。

1.3 支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)蛋白濃度和白細(xì)胞計數(shù)

各組處死大鼠后立即開胸取肺，切開右肺主支氣管，插入外徑為1.8 mm的氣管插管軟管固定，左肺結(jié)扎，用每份3 ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)連續(xù)灌洗右肺3次，并回收灌洗液，最后將回收BALF合并，取出80 μl BALF，離心染色并進行白細(xì)胞計數(shù)。將剩余的BALF，4℃以1 500 r/min離心20 min，取上清液儲存在-80℃冰箱保存，用于測定蛋白濃度。

1.4 實時定量PCR(qRT-PCR)檢測鈉通道各亞型mRNA的表達(dá)

取左肺肺組織，按總RNA提取試劑盒說明進行操作，用分光光度法在260和280 nm測定總RNA濃度和質(zhì)量，同時用甲醛瓊脂糖凝膠電泳評估RNA完整性，將總RNA保存在-80℃。實時定量PCR分析采用qRT-PCR試劑盒和熒光染料摻入法進行，按試劑盒說明進行操作，用于擴增GAPDH(內(nèi)源參照基因)以及不同的ENaC靶基因mRNA序列，根據(jù)美國Thermofisher公司生物技術(shù)信息序列數(shù)據(jù)庫和程序的信息設(shè)計基因特異性引物組，引物序列如表1。參照說明，在95℃孵化30 s后，再以95℃10s PCR循環(huán)35次，60 ℃20 s和72℃20 s，最后β-Actin或GAPDH為內(nèi)參，熔解曲線分析。

表1 引物序列

1.5 Westen-bolt法檢測鈉通道各亞型蛋白的表達(dá)

取左肺組織加1 ml裂解液，然后12 000 r/min 4℃離心2 min，取少量上清Lowry 法測定總蛋白量。每孔蛋白加樣量為20 μg，通過80-100V電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜在100V在冷水浴1 h。PVDF膜與PBS含BSA封閉1 h，并孵育抗體(1∶1 000)在4℃，PVDF膜過夜，用PBST洗滌3次，再與HRP標(biāo)記的二抗孵育(1∶10 000)在37℃ 1 h，與PBST洗3次后，按Western blot檢測試劑盒說明進行快速孵育，最后用化學(xué)發(fā)光法顯影，將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BALF蛋白濃度和白細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

與Control組比較，LPS組、HCL組和VILI組BALF蛋白濃度和白細(xì)胞計數(shù)均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 BALF蛋白濃度和白細(xì)胞計數(shù)

注：與對照組比較aP<0.05

2.2 qRT-PCR檢測mRNA的表達(dá)結(jié)果

與Control組比較，α-ENaCmRNA表達(dá)在LPS組和HCL組中明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而α-ENaCmRNA表達(dá)在VILI組與Control組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；β-ENaCmRNA表達(dá)各組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Control組比較，γ-ENaCmRNA在VILI組表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在LPS組和HCL組表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

注：與Control組比較，*表示 P<0.05。

2.3 Westen-bolt法檢測鈉通道各亞型蛋白表達(dá)結(jié)果

與Control組比較，α-ENaC蛋白表達(dá)在LPS組和HCL組明顯降低(P<0.05)，而γ-ENaC蛋白表達(dá)在VILI組明顯降低(P<0.05) ，見圖2。

3 討論

急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床上常見的危重病癥，其特征是彌漫性肺泡損傷，毛細(xì)血管通透性增加和凝血系統(tǒng)的強烈激活。ARDS誘發(fā)因素(如敗血癥、創(chuàng)傷、誤吸和肺炎等)相當(dāng)常見，但只有少數(shù)患者發(fā)展為綜合征,這種差異性反應(yīng)提示可以對ARDS易感性和預(yù)后的潛在因素進行研究。

圖2 ENaC各亞型蛋白表達(dá)(n=10)

阿米洛利敏感上皮鈉通道(ENaC)，在健康和疾病中發(fā)揮重要作用，在腎，結(jié)腸和肺中均有表達(dá)[5]。ENaC通過重吸收頂膜上的Na+參與維持適宜的鹽和水平衡，從而形成促進液體重吸收的滲透梯度，Na+在肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運促使了肺泡液的轉(zhuǎn)運，是肺水腫液清除的主要驅(qū)動力。ENaC調(diào)控Na+的轉(zhuǎn)運，在肺泡水腫液體的清除過程中發(fā)揮重要作用[6-9]。ENaC由α，β和γ亞基組成，有研究表明，缺乏α-ENaC表達(dá)的新生小鼠由于無法清除肺泡內(nèi)多余的液體,在出生后48 h 內(nèi)死亡[10]。Mall等[11]發(fā)現(xiàn)，β-ENaC過度表達(dá)導(dǎo)致肺泡上皮Na+攝取增加，導(dǎo)致肺部脫水并引起肺囊性纖維化樣變。Naomi等[12]研究人呼吸道上皮ENaCmRNA水平與細(xì)胞上皮基底部電位差(PD)之間的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，PD 的降低與γ-ENaCmRNAs表達(dá)水平的升高存在相關(guān)關(guān)系,而α或β-ENaCmRNA的水平與PD 之間沒有相關(guān)關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示3種急性肺損傷實驗?zāi)Ｐ虰ALF蛋白濃度和白細(xì)胞計數(shù)均顯著升高(P<0.05)，提示3種模型均使肺泡壁通透性增加及氣血屏障的完整性被破壞。本研究發(fā)現(xiàn)α-ENaCmRNA表達(dá)和蛋白的表達(dá)在LPS組和HCL組中明顯降低(P<0.05)，提示這兩組損傷作用可能主要發(fā)生在肺泡上皮頂膜上Na+電導(dǎo)所必需的α亞基，損害肺泡上皮液體輸送功能，導(dǎo)致肺泡液體清除作用降低。本研究還發(fā)現(xiàn)γ-ENaCmRNA表達(dá)和蛋白的表達(dá)在VILI組明顯降低(P<0.05)，提示高潮氣量的機械通氣損傷作用于可能是抑制了上皮細(xì)胞增強信號通路的γ亞基的表達(dá)。而β-ENaCmRNA表達(dá)和蛋白的表達(dá)在肺損傷實驗?zāi)Ｐ椭袩o明顯變化(P>0.05)，提示β亞基表達(dá)水平可能在肺損傷模型中不會降低。

本研究通過對3種急性肺損傷實驗?zāi)Ｐ虴NaC各亞基的檢測，表明肺損傷具有靶向特異性調(diào)節(jié)基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，從而反映不同急性肺損傷的共同潛在原因，為促進肺泡水腫液清除和治療肺損傷提供依據(jù)。

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