沈立君 黃永平 祝學(xué)勇 劉葉 李紅良

心肌肥厚是由生理或病理刺激導(dǎo)致的心臟復(fù)雜的重塑過(guò)程，早期階段，心臟肥厚是針對(duì)各種刺激產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，可以有效的改善心功能，降低心室壁張力。但是，長(zhǎng)期持續(xù)性的病理性心肌肥厚導(dǎo)致心臟擴(kuò)張及一系列失代償反應(yīng)，最終導(dǎo)致心力衰竭甚至猝死的發(fā)生[1]。尋找靶向心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子是預(yù)防和治療病理性心肌肥厚及其所導(dǎo)致的心力衰竭的有效手段。

酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成員A(acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A, Anp32a)，屬于進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)家族，其結(jié)構(gòu)特征是富含亮氨酸殘基的氨基端結(jié)構(gòu)域和羧基端酸性末尾。研究表明，Anp32a參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的調(diào)節(jié)，包括RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞凋亡，囊泡運(yùn)輸和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]。Anp32a在正常組織以及多種癌癥，如乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中表達(dá)，并且能夠抑制乳腺癌和前列腺癌的進(jìn)展，同時(shí)也參與調(diào)控神經(jīng)退行性疾病[3]。筆者以Anp32a敲低和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞為研究對(duì)象，以探討Anp32a在血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1生物信息數(shù)據(jù)分析

在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中搜索小鼠心臟主動(dòng)脈縮窄手術(shù)(TAC)組的芯片數(shù)據(jù)，選擇GSE5500數(shù)據(jù)庫(kù)插入一篇參考文獻(xiàn)中假手術(shù)(Sham)組與TAC組進(jìn)行差異分析。使用R軟件包affy讀取基因芯片的數(shù)據(jù)，R軟件包gcrma對(duì)芯片基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異表達(dá)倍數(shù)大于2，且統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)P值小于0.05。使用R語(yǔ)言ggplot2軟件包，繪制基因表達(dá)的火山圖。

1.2小鼠心臟主動(dòng)脈縮窄手術(shù)

C57背景野生型，SPF級(jí)，8～10周齡雄性小鼠，隨機(jī)分為模型組和假手術(shù)組，利用主動(dòng)脈縮窄手術(shù)構(gòu)建心肌肥厚模型。小鼠稱重后，3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，左側(cè)胸部備皮，固定于倒V形板斜面上，進(jìn)行氣管插管并連接呼吸機(jī)。用碘酒及75%酒精充分消毒手術(shù)區(qū)域皮膚3遍，于第二、三肋間距胸骨左緣2 mm處用剪刀分離肋間肌打開(kāi)胸腔，顯微擴(kuò)胸器將胸部擴(kuò)開(kāi)，充分暴露手術(shù)視野，鈍性分離出主動(dòng)脈弓降支，將7-0手術(shù)絲線穿過(guò)血管，墊針平行放置于主動(dòng)脈上，打結(jié)后迅速去除墊針，術(shù)畢關(guān)閉胸腔。術(shù)后密切觀察小鼠狀態(tài)。假手術(shù)組鈍性分離主動(dòng)脈降支后僅穿線不結(jié)扎，余步驟與模型組一致。

1.3細(xì)胞與分子實(shí)驗(yàn)

1.3.1分子克隆 引物序列(Anp32a-seq-F CCGCTCGAGATGGAGATGGACAA，Anp32a-seq-R CGCGGATCCGTTAGTCATCCTCTTG)，由上海生工生物工程股份有限公司合成，從大鼠cDNA擴(kuò)增Anp32a，通過(guò)XhoI和BamHI酶切與載體pENTR-CMV連接，構(gòu)建穿梭載體，通過(guò)Gateway?LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(Invitrogen公司)試劑盒將pENTR-CMV-Anp32a載體與pAd-PL-DEST載體重組，得到包裝腺病毒的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。

針對(duì)大鼠Anp32a基因序列設(shè)計(jì)RNA干擾靶序列GCAGAGAAATGTCCGAACCTT，在該序列基礎(chǔ)上合成shRNA正義鏈：CCGGGCAGAGAAATGTCCGAACCTTCTCGAGAAGGTTCGGACATTTC-TCTGCTTTTTG，反義鏈：AATTCAAAAAGCAGAGAAATGTCCGAACCTTCTCGAGAAGG-TTCGGACATTTCTCTGC，引物融合后與AgeI和EcoRI酶切的載體pENTR-U6連接，構(gòu)建穿梭載體，通過(guò)Gateway?LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix(Invitrogen公司)試劑盒將pENTR-U6-Anp32a-shRNA載體與pAd-PL-DEST載體重組，得到包裝腺病毒的敲低質(zhì)粒。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染與感染 重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切線性化、純化，然后轉(zhuǎn)染293A 細(xì)胞擴(kuò)增，最后將多次擴(kuò)增的病毒液利用氯化銫密度梯度離心-透析聯(lián)用法進(jìn)行純化。利用穿梭質(zhì)粒上帶有的獨(dú)立啟動(dòng)子表達(dá)的GFP來(lái)初步判定病毒液的滴度。用純化后的病毒液感染H9C2心肌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞饑餓處理12 h，加入終濃度為1 μmol/L 的AngⅡ刺激細(xì)胞，對(duì)照組使用等量PBS混合，刺激時(shí)間48 h。

1.3.3蛋白印記(Western blot)檢測(cè) 提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(23225; Thermo Fisher Scientific)定量并調(diào)平樣品濃度，將蛋白樣品按30 μg/孔的上樣量依次加到SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放置TBS中洗去轉(zhuǎn)膜液，5%的脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)一抗，4℃搖床過(guò)夜，次日加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，于儀器Bio-RadChemiDocTMXRS+中顯影，檢測(cè)目的條帶。文中所用到的一抗包括Anp32a(sc-5652, Santa cruz公司)，Anp(A1609, Abclonal公司)，β-Mhc(22280-1-AP, Proteintech公司)，p-Akt(4060, CST公司)，Akt(4691, CST公司)，Gapdh(2118, CST公司)。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR) 使用TRIZOL(15596-026，Invitrogen)提取細(xì)胞、小鼠心臟組織總RNA，Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，Madison)和凝膠電泳對(duì)分離的RNA進(jìn)行定量并檢測(cè)其完整性。按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(4896866001; Roche)說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA。使用LightCycler 480 SYBR Green 1 Master Mix(04887352001，Roche)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量。采用Gapdh作為內(nèi)參基因校準(zhǔn)靶基因。文中所用到的引物(武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成)見(jiàn)表1。

表1 qPCR所需的引物序列

1.3.5細(xì)胞免疫熒光染色 細(xì)胞大小及面積通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色分析[4]。腺病毒感染24 h后，用AngII及PBS處理H9C2心肌細(xì)胞48 h，將細(xì)胞置于預(yù)熱(37℃)的100%甲醇中孵育20 min,以淬取GFP綠色熒光信號(hào)，用0.1%Triton X-100于PBS中洗5 min，并用α-輔肌動(dòng)蛋白(05-384，Merck Millipore，1∶100稀釋)染色，加入熒光二抗(驢抗小鼠IgG(H + L)二抗，A21202 ，Invitrogen，1∶200)，DAPI封片，于正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有檢測(cè)結(jié)果均使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間均數(shù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)心臟組織Anp32a的表達(dá)

通過(guò)挖掘分析數(shù)據(jù)庫(kù)(GSE5500)中小鼠心臟組織假手術(shù)組與TAC組的芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Anp32a的表達(dá)顯著下調(diào)。如圖1所示，紅色的點(diǎn)代表TAC手術(shù)后表達(dá)上調(diào)的基因，綠色的點(diǎn)代表TAC手術(shù)后表達(dá)下調(diào)的基因，黑色的點(diǎn)代表沒(méi)有變化的基因。

圖1 火山圖

2.2Anp32a在假手術(shù)組及TAC組不同時(shí)間點(diǎn)心臟組織中的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示Anp32a在兩組心臟組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，與假手術(shù)組相比，Anp32a在TAC組的表水平隨著TAC手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低。見(jiàn)表2。

表2 不同組別Anp32a基因表達(dá)

注：與sham組相比，*P<0.05

2.3AdAnp32組及AdGFP組細(xì)胞大小及心肌肥厚指標(biāo)表達(dá)水平的比較

Western blot顯示AdAnp32感染細(xì)胞其蛋白表達(dá)水平增加(見(jiàn)圖2A)，在AdAnp32a感染心肌細(xì)胞24 h后，AngII刺激48 h，免疫熒光染色結(jié)果顯示AdAnp32a組細(xì)胞明顯小于AdGFP對(duì)照組(見(jiàn)圖2B)。Image-Pro Plus 6.0分析計(jì)數(shù)400倍顯微鏡下心肌細(xì)胞面積(cell surface area, CSA)，結(jié)果見(jiàn)表3。進(jìn)一步裂解細(xì)胞取其上清，通過(guò)qPCR進(jìn)行心肌肥厚相關(guān)基因Anp、Bnp、β-Mhc的檢測(cè)。如表4所示，AdAnp32a組與其對(duì)照AdGFP組相比，Anp、Bnp、β-Mhc基因表達(dá)水平降低。

圖2 AdGFP組和AdAnp32a組蛋白表達(dá)(A)和免疫熒光染色(B)

表3 兩組細(xì)胞大小面積統(tǒng)計(jì)/μm2

注：與AdGFP組比較，*P<0.05

表4 不同組別心肌肥厚基因表達(dá)

注：n=3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4AdshAnp32組及AdshRNA組細(xì)胞大小及心肌肥厚指標(biāo)表達(dá)水平的比較

Western blot顯示AdshAnp32感染細(xì)胞檢測(cè)Anp32a蛋白表達(dá)水平明顯降低(見(jiàn)圖3A)，細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示AdshAnp32a組細(xì)胞較AdshRNA對(duì)照組明顯增大(見(jiàn)圖3B)。細(xì)胞面積分析結(jié)果見(jiàn)表5。提取細(xì)胞總RNA，qPCR檢測(cè)兩組Anp、Bnp、β-Mhc的基因表達(dá)，AdshAnp32a上述基因表達(dá)較其對(duì)照組明顯升高，見(jiàn)表6。

圖3 兩組Western blot結(jié)果(A)和細(xì)胞免疫熒光染色(B)

表5 兩組細(xì)胞大小面積統(tǒng)計(jì)/μm2

注：與AdshRNA組組比較，*P<0.05

表6 兩組心肌肥厚基因表達(dá)

注：n=3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。與AdshRNA組比較，*P<0.05

2.5Anp32a對(duì)AKT信號(hào)通路的影響

如圖4所示，與PBS對(duì)照組相比，AngⅡ刺激條件下，Anp、β-Mhc、Akt磷酸化蛋白的水平升高,過(guò)表達(dá)Anp32a能抑制其升高。

圖4 Anp、β-Mhc、p-Akt的蛋白表達(dá)

3 討論

本研究采用Anp32a敲低和過(guò)表達(dá)的H9C2心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)AngⅡ刺激來(lái)探討Anp32a基因在心肌細(xì)胞肥大中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Anp32a在心肌肥厚模型中表達(dá)顯著降低，這與Gao等[5]研究結(jié)果相似。過(guò)表達(dá)Anp32a明顯減輕AngⅡ刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，并且顯著降低Akt的磷酸化水平。因此，Anp32a可能通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路，在AngⅡ刺激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程中起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。

Anp32a家族的成員被廣泛認(rèn)為是核-質(zhì)穿梭蛋白，涉及不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及許多重要的細(xì)胞過(guò)程，包括增殖、分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤抑制、調(diào)節(jié)mRNA運(yùn)輸和穩(wěn)定性、抑制組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和基于微管功能的調(diào)節(jié)。Anp32a結(jié)構(gòu)上由富含亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)結(jié)構(gòu)域的高度保守的N-末端和主要由聚谷氨酸組成的C-末端組成，其中前者是介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的基序[6]。在當(dāng)前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Anp32a能夠在心肌細(xì)胞中表達(dá)，且在病理性心肌肥厚中表達(dá)顯著下調(diào)。通過(guò)構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)Anp32a敲低和過(guò)表達(dá)的質(zhì)粒，我們首次發(fā)現(xiàn)Anp32a敲低(AdshAnp32a)能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大，而Anp32a過(guò)表達(dá)(AdAnp32a)則抑制這一過(guò)程。

病理性心肌肥厚發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)、絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)、鈣調(diào)磷酸酶-NFAT通路(calcineurin-NFAT circuit)、磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K-AKT)信號(hào)通路等[7-8]在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。其中，S473和T308介導(dǎo)的AKT磷酸化激活在細(xì)胞存活、增殖、代謝、生長(zhǎng)等方面發(fā)揮重要作用。值得注意的是，在出生后的心臟中，PI3K-AKT-FOXO軸調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞大小，其中AKT和FOXO3a的磷酸化水平與體內(nèi)心臟肥大呈正相關(guān)[9]。我們的研究結(jié)果顯示，AdAnp32a能夠抑制AngII刺激誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚中磷酸化的AKT水平的上調(diào)。此外，Anp32a是磷酸酶2A(PP2A)的強(qiáng)效抑制劑[10]，而PP2A是參與調(diào)控細(xì)胞多種基本功能的重要絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶[11]。PP2A可能參與Anp32a-AKT調(diào)控的病理性心肌肥厚。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Anp32a在心肌細(xì)胞肥大模型中表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)Anp32a可有效抑制心肌細(xì)胞肥大，這一作用可能是通過(guò)抑制AKT等信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。因此，靶向Anp32a可能成為預(yù)防和治療病理性心肌肥厚的新策略。

1 Benjamin EJ, Blaha MJ, Chiuve SE, et al. Heart Disease and Stroke Statistics——2017 Update: A Report From the American Heart Association [J]. Circulation, 2017, 135(10): p. e146

2 Opal P, Garcia JJ, McCall AE, et al. Generation and characterization of LANP/pp32 null mice [J]. Mol Cell Biol, 2004, 24(8): 3 140

3 Huyton T， Wolberger C. The crystal structure of the tumor suppressor protein pp32 (Anp32a): structural insights into Anp32 family of proteins [J]. Protein Sci, 2007, 16(7): 1 308

4 Deng KQ, Wang A, Ji YX, et al. Suppressor of IKKε is an essential negative regulator of pathological cardiac hypertrophy [J]. Nat Commun, 2016, 7: 11 432

5 Gao J, Li Y, Wang T, et al. Analyzing gene expression profiles with preliminary validations in cardiac hypertrophy induced by pressure-overload [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2018

6 Matilla A, Radrizzani M. The Anp32 family of proteins containing leucine-rich repeats [J].Cerebellum, 2005, 4(1): 7

7 Heineke J, Molkentin JD. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2006, 7(8): 589

8 Manning BD, Toker A. AKT/PKB signaling: navigating the network [J]. Cell, 2017, 169(3): 381

9 Skurk C, Izumiya Y, Maatz H, et al. The FOXO3a transcription factor regulates cardiac myocyte size downstream of AKT signaling [J]. J Biol Chem, 2005, 280(21): 20 814

10 de Chiara C, Menon RP, Pastore A. Structural bases for recognition of Anp32/LANP proteins [J]. FEBS J, 2008, 275(10): 2 548

11 Costanzo RV, Vilá-Ortíz GJ, Perandones C, et al. Anp32e/Cpd1 regulates protein phosphatase 2A activity at synapses during synaptogenesis [J]. Eur J Neurosci, 2006, 23(2): 309