東山島星座短腹海鞘共附生微生物多樣性研究

喬玉寶， 田曉清， 唐瑩瑩， 樊成奇， 馬麗艷， 陸亞男

(1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗室，上海 200090； 2上海海洋大學(xué)，上海 201306)

星座短腹海鞘(Aplidiumconstellatum，也稱星座褶胃海鞘),原名星座美洲海鞘(AmarouciumconstellatumVerrill，也稱星座列精海鞘 )，屬脊索動物門(Chordata)尾索動物亞門(Urochordata)海鞘綱(Asciacea)三段海鞘科(Polyclinidae)短腹海鞘屬(或稱褶胃海鞘屬)，為復(fù)海鞘，在渤海、黃海、東海海域均有分布，是我國海鞘常見優(yōu)勢物種之一[1-2]。此前已有文獻(xiàn)報道從該屬海鞘中分離出了具有多種骨架類型的生物堿、酚醌、環(huán)肽、大環(huán)內(nèi)酯等成分，并顯示出抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[3-4]，提示其可能具有藥學(xué)或保健方面的應(yīng)用價值。但迄今為止，尚未有關(guān)于星座短腹海鞘共附生微生物及其活性物質(zhì)的報道。前期對星座短腹海鞘脂溶性提取物進(jìn)行了研究，首次發(fā)現(xiàn)其具有降血脂功效，提示其可能具有進(jìn)一步的開發(fā)利用價值，并開展了其脂溶性提取物提取工藝的初步研究[5-6]。

已有研究表明，海洋生物次生代謝產(chǎn)物的類型與多樣性與其共附生微生物的次生代謝產(chǎn)物類型與多樣性具有較強(qiáng)的相關(guān)性。海鞘中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源，其共附生微生物中可能存在著與海鞘生物中相類似的活性天然產(chǎn)物[7-8]。為進(jìn)一步研究該海鞘及其共附生微生物的次生代謝產(chǎn)物，本文以福建東山島采集的星座短腹海鞘為研究材料，通過免培養(yǎng)微生物高通量測序技術(shù)和純培養(yǎng)技術(shù)對其細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，一方面通過高通量測序技術(shù)首次解析了其共附生菌群的種類、豐度及多樣性信息，另一方面也積累了豐富的該種海鞘共附生微生物菌種資源，以期為進(jìn)一步探索海鞘與微生物之間的共生、附生關(guān)系，并開展海鞘降血脂活性物質(zhì)的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

星座短腹海鞘于2017年5月采自福建漳州東山島海域。采集后用大量海水沖洗并快速置于4 ℃冷藏保存，24 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗室進(jìn)行分析。

Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)；16 s引物(上海生工生物有限公司)；PCR擴(kuò)增體系(北京康為世紀(jì))。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 高通量測序

星座短腹海鞘(20 g)樣品用無菌海水清洗3次，清洗干凈表面的泥沙，將清洗好的樣品用滅菌研缽研磨成漿，然后用適量無菌海水進(jìn)行稀釋，備用。

DNA抽提：使用 Stool DNA Kit 試劑盒(OMEGA，美國)提取星座短腹海鞘樣品微生物的DNA。所有樣品的DNA 提取步驟均參照Stool DNA Kit試劑盒說明書。對提取到的樣品基因組DNA 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。

PCR擴(kuò)增：針對細(xì)菌16S rRNA基因V3 + V4 區(qū)設(shè)計含 barcode 的特異引物338F /806R，引物序列為：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG - 3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′。PCR擴(kuò)增采用TransGen AP221-02：TransStart FastPfu DNA Polymerase，20 μL反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μM) 0.8 μL，Reverse Primer(5 μM) 0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR條件：95 ℃變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min延伸(PCR儀：ABI Gene Amp? 9700型)。然后將獲得PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫； 2%瓊脂糖電泳檢測。

Miseq文庫構(gòu)建及Miseq測序：構(gòu)建測序文庫后在 Illumina Miseq平臺進(jìn)行高通量測序(美吉生物公司，上海)[9]。

數(shù)據(jù)質(zhì)控：MiSeq測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。數(shù)據(jù)去雜方法和參數(shù)：1)過濾reads尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控后50bp以下的reads，去除含N堿基的reads；2)根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長度為10 bp；3)拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；4)根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2；使用軟件：FLASH、Trimmomatic。

數(shù)據(jù)分析：按照97%相似性對非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，得到OTU的代表序列;將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個分類水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統(tǒng)計各樣本的群落組成。16S細(xì)菌比對數(shù)據(jù)庫：Silva、RDP、Greengene。

軟件及算法: Qiime平臺， RDP Classifier，置信度閾值為0.7。

1.2.2 可培養(yǎng)共附生菌的分離及鑒定

可培養(yǎng)共附生菌的分離：將1.2.1中剩余海鞘研磨樣品用適量無菌海水稀釋，置4 ℃冰箱過夜，次日取上清液用無菌海水進(jìn)行梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4，分別涂布于2216E培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)10 d。待平板菌落長成，挑取不同形狀、不同顏色的菌落平板劃線進(jìn)行純化，最后挑取劃線平板上單菌落接到斜面上，保種備用。

可培養(yǎng)共附生菌的鑒定：1)細(xì)菌基因組DNA的制備：將已生長到對數(shù)期的斜面菌落，接種到5 mL 2216液體培養(yǎng)基中，置于搖床28 ℃培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取目標(biāo)基因組DNA。2)引物設(shè)計：海洋細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增選用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3)PCR擴(kuò)增體系為50 μL∶2×TaqPCR MasterMix 25 μL，引物各1 μL，模板DNA 3 μL，重蒸水20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min[10]。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳[11]。4)DNA測序和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分析：委托上海美吉生物公司完成測序。獲得的16S rRNA基因序列提交GenBank用BLAST 軟件與已知序列進(jìn)行對比，利用MEGA 5.1軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品信息統(tǒng)計

星座短腹海鞘所獲得的37 911條序列長度分布在293～480(表1)，420～440范圍內(nèi)序列最多，為30 325條，其次是441～460，為7 502條(圖1)。

圖1 序列長度分布Fig.1 Length distribution of trimmed sequences

從稀釋曲線來看，隨著測序量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量的新的物種(圖2)。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve

2.2 物種注釋與評估

可操作分類單元(OTU，operational taxonomic units) 是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)Greengene或群體遺傳學(xué)研究中，為了便于進(jìn)行分析，人為給某一個分類單元(品系，種，屬，分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。要了解一個樣本測序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，就需要對序列進(jìn)行聚類。通過聚類操作，對各個樣品的有效序列進(jìn)行系譜分類，以 97%相似性水平為標(biāo)準(zhǔn)劃分OTU[11]，使得星座短腹海鞘共附生微生物所獲得的37 911條序列分為310個OTUs，注釋到24個門，41個綱，84個目，124個科，197個屬，249個種。

從多樣性指數(shù)表來看，ace值和chao值分別為310.327和310.091，說明所測樣品中所含OTU數(shù)目為310；Simpson值為0.373，Shannon值為2.494，說明所測樣品群落多樣性較高；樣本覆蓋率(Coverage)為99.99%，說明本次測序結(jié)果可以代表樣本中微生物的真實(shí)情況(表2)。

2.3 物種組成分析

從門的水平來看(圖4)，星座短腹海鞘共附生微生物優(yōu)勢門有7個，分別為變形菌門(Proteobacteria，78.86%)、放線菌門(Actinobacteria，6.01%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，4.67%)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria，2.62%)、厚壁菌門(Firmicutes,1.79%)、柔膜菌門(Tenericutes，1.76%)、螺旋菌門(Spirochaetae，1.33%)，其它的17個門占2.95%。

表1 樣本信息統(tǒng)計表Tab.1 Sample information statistics

圖3 星座短腹海鞘共附生菌門水平分布圖Fig.3 The phylum level distribution of Aplidium constellatum associated bacteria

從屬的水平來看(圖3)，星座短腹海鞘共附生微生物分屬于197個屬，優(yōu)勢屬有10個，分別為Ruegeria(60.83%)、SAR116_clade科下未知屬(3.27%)、Rhodococcus(2.40%)、Cyanobacteria綱下未知屬(2.26%)、Candidatus_Hepatoplasma(1.76%)、PeM15目下未知屬(1.61%)、Spirochaetaceae科下未分類屬(1.33%)、Thalassobius(1.26%)、Rhodobacteraceae科下未分類屬(1.23%)、Rhodospirillaceae科下未分類屬(1.08%)。

2.4 星座短腹海鞘可培養(yǎng)微生物類群的多樣性

從星座短腹海鞘中共分離獲得15株可培養(yǎng)共附生菌，對這15株可培養(yǎng)共附生菌16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(表3)，結(jié)果表明，15株可培養(yǎng)共附生菌分屬于8個屬，分別為弧菌屬Vibrio(7株)、希瓦氏菌屬Shewanella(2株)，其余的屬Pseudomonas、Pseudovibrio、Thalassobius、Exiguobacterium、Flavobacterium、Thalassospira各1株。從相似度來看，15株可培養(yǎng)共生菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中菌種相似度在98%以上?；?6S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析見圖 5。

表2 多樣性指數(shù)表Tab.2 Table of alpha diversity indices

圖4 星座短腹海鞘共附生菌屬平分布圖Fig.4 The genus level distribution of Aplidium constellatum associated bacteria

屬 Genus菌株編號 Strain No.相近模式菌株 Similar strain相似度/% SimilarityVibrio XZDF-10Vibrio tasmaniensis LMG 21574T (AJ514912)99.24XZDF-11Vibrio atlanticus Vb 11.11T (EF599163)99.17XZDF-16Vibrio neocaledonicus NC 470T (JQ934828)99.22XZDF-20Vibrio hyugaensis 090810aT (LC004912)99.86XZDF-24Vibrio crassostreae LGP 7T (CCJW01000022)99.31XZDF-25Vibrio chagasii R-3712T (AJ316199)98.80XZDF-7Vibrio cyclitrophicus P-2P44T (U57919)98.34ShewanellaXZDF-14Shewanella loihica PV-4T (CP000606)98.07XZDF-23Shewanella aquimarina SW-120T (AY485225)99.10PseudomonasXZDF-8-1Pseudomonas zhaodongensis NEAU-ST5-21T(JQ762275)98.93PseudovibrioXZDF-8-2Pseudovibrio ascidiaceicola DSM 16392T (AB175663)99.57ThalassobiusXZDF-12Thalassobius aestuarii DSM 15283T (AY442178)99.12ExiguobacteriumXZDF-13Exiguobacterium aestuarii TF-16T (AY594264)98.90FlavobacteriumXZDF-15Flavobacterium rakeshii FCS-5T (JF830803)99.51ThalassospiraXZDF-26Thalassospira xiamenensis M-5T (CP004388)98.71

圖5 基于16S rRNA序列構(gòu)建的星座短腹海鞘可培養(yǎng)共附生菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis of 16S rRNA sequences

3 討論

本文通過高通量測序技術(shù)首次解析了星座短腹海鞘共附生微生物種類、豐度及多樣性信息，此結(jié)果對于深化對海鞘共附生多樣性的認(rèn)識，指導(dǎo)其可培養(yǎng)共附生微生物的分離具有重要意義。

從研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過純培養(yǎng)技術(shù)所得到的可培養(yǎng)共附生微生物種屬數(shù)量較少，可能是由于本實(shí)驗只使用了2216E一種海洋培養(yǎng)基的緣故。以往的研究結(jié)果表明，使用不同的培養(yǎng)基對于微生物的多樣性發(fā)現(xiàn)有較大影響。因此在后續(xù)研究中應(yīng)當(dāng)增加分離培養(yǎng)基的種類，以提高共附生微生物的分離效果[8]。

研究結(jié)果顯示，從星座短腹海鞘中分離出的細(xì)菌中有弧菌、希瓦氏菌這兩種致病菌，這可能與本實(shí)驗采集海鞘的地點(diǎn)為當(dāng)?shù)刂饕ＫB(yǎng)殖區(qū)有關(guān)，樣本可能在生長過程中受到養(yǎng)殖水產(chǎn)病害的污染。雖然這兩種致病菌并不屬于優(yōu)勢菌株，但仍然提示在后期的海鞘開發(fā)利用過程中，應(yīng)注意原料來源；在原料采集或共附生微生物的規(guī)?；囵B(yǎng)中，要注意監(jiān)測水產(chǎn)致病菌的存在情況，避免可能帶來的安全隱患。

以往對海鞘共附生微生物的研究多采用純培養(yǎng)方式，本實(shí)驗采用了高通量測序方法。這主要是由于海洋中有許多微生物是不可培養(yǎng)的，只靠純培養(yǎng)技術(shù)不能全面了解微生物多樣性，而Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)打破了純培養(yǎng)技術(shù)的限制，使得人們可以更快捷、全面了解微生物多樣性。因此，在以后的共附生微生物多樣性的研究中，結(jié)合高通量測序技術(shù)與純培養(yǎng)方法來探討海洋微生物多樣性，將更有助于深化人們對微生物資源的認(rèn)識。

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