化州柚SCoT-PCR反應體系的優(yōu)化及分類鑒別研究

王浩涵， 楊潔清， 歐陽小健， 孫楊楊， 黃海波

(廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州 510006)

化橘紅藥用歷史悠久，療效顯著，具有理氣寬中、燥濕化痰等功效，用于治療嘔惡痞悶、咳嗽痰多等病癥，為廣東十大南藥之一，主要產于廣東化州。化橘紅基原植物為蕓香科柑橘屬化州柚(CitrusmaximaTomentosa)或柚(CitrusmaximaL. Osbeck)及其栽培變種[1]，前者別稱毛橘紅，后者別稱光橘紅。在目前的研究中普遍認為毛橘紅的質量優(yōu)于光橘紅[2-3]，而光橘紅產量大，成本低，品種來源廣泛，容易與毛橘紅混淆，已經對毛橘紅市場造成了沖擊。目前市場中的毛橘紅基原也較復雜，僅文獻中提及的就有鳳尾、假西洋、密葉、黃龍、金錢臍等十余個品種，并且在植物形態(tài)及質量上均有差異[4-5]。大量柚類及化州柚品種都可能被用作化橘紅藥材，而其在苗期難以區(qū)分，因此，開發(fā)一種可靠有效的方法有助于準確鑒別化橘紅基原植物及其種苗。

目標起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism，簡稱SCoT)是Collard等于2009年在水稻上提出的一種新型分子標記[6]。該標記是針對ATG起始密碼子側翼的保守序列設計的單引物，其擴增的片段多偏向候選功能基因，目前在化州柚的種質資源研究中尚未見報道。本研究通過正交試驗設計構建SCoT-PCR的最佳反應體系，篩選引物并優(yōu)化其最佳退火溫度，對不同品種化州柚及柚類進行遺傳多態(tài)性分析，構建其非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA)聚類樹，以期為化橘紅基原植物的鑒別分類提供一種有效可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料均采集自植株頂芽往下第3～5張幼嫩葉片，用吸水紙吸干表面水分后用塑封袋封口，2 d內放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩１驹囼炗?017年4—11月在廣州中醫(yī)藥大學創(chuàng)新中藥研發(fā)公共服務平臺分子生物學實驗室進行，樣品由廣州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定，憑證標本保存于廣州中醫(yī)藥大學，樣品詳細信息見表1。

1.2 試驗儀器和試劑

OSE-Y20電動研磨儀，購自天根生化科技(北京)有限公司；Centrifuge 5424R冷凍離心機，購自Eppendorf公司；NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計、Arktik PCR儀，購自Thermo公司；Power Pac Basic電泳儀，購自Bio-Rad公司；Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)，購自上海天能科技有限公司。

dNTPs、Mg2+、10×ExTaqBuffer(無Mg2+)、ExTaqDNA聚合酶、瓊脂糖、DL5000 maker、Goldview Ⅰ，購自TaKaRa公司；β-巰基乙醇、Tris平衡酚、Tris-乙酸電泳緩沖液(50×TAE)，購自廣州瑞舒生物科技有限公司；DP305植物基因組DNA提取試劑盒、6×上樣緩沖液(loading buffer)，購自天根生化科技有限公司；其余均為國產分析純試劑。36條SCoT引物序列均參照文獻[6]，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3 DNA提取

稱取0.1 g樣品置于經預冷的1.5 mL離心管中，加入液氮使葉片充分冷凍，用研磨儀迅速將其研成粉末。試驗步驟參照天根DP305植物基因組DNA提取試劑盒說明書進行，為提取到濃度更好的DNA，增加水浴時間至1 h。

1.4 DNA質量檢測

采用瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA降解情況。取1 μL DNA，在超微量分光光度計下檢測吸光度以測定其濃度及純度，并將所有樣品稀釋至50 ng/μL。

表1 化州柚及其近緣品種樣品信息

注：*表示未查找到拉丁名。

1.5 SCoT-PCR反應體系正交試驗設計

引物選擇S32，樣品采用A6化州橘紅研究所的化州柚(鳳尾)，對PCR體系的5個主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和DNA模板的用量進行優(yōu)化，每個影響因素設置5個水平(表2)。正交試驗共25組，每組重復3次，反應采用20 μL體系，每個體系添加1×PCR buffer，余量以ddH2O補足。

1.6 PCR擴增及電泳檢測

PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，49 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。取5 μL擴增產物與1 μL loading buffer混勻，在GoldView 染色后的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳， 緩沖液為1×TAE，電壓為120 V，時間為1 h，最后于凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

表2 L25(56)正交因素水平設計

1.7 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

采用優(yōu)化后的最佳反應體系對6個樣品(A4吳川正毛、A8清湖假西洋、A9大嶺假西洋、A11廣中醫(yī)正毛、A20紅玉香柚、A25檸檬)篩選所有引物，選擇條帶清晰、間距明顯且多態(tài)性好的引物進行退火溫度篩選。在ArkTik PCR儀上設定溫度范圍46～55 ℃，在自動生成的12個梯度溫度中選擇9個溫度(46.0、47.4、48.4、49.6、51.1、52.5、53.5、54.3、55.0 ℃)對條帶清晰、多態(tài)性好的引物進行優(yōu)化。

1.8 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計

1.8.1 反應體系正交分析 對正交設計的凝膠圖像采用姜小鳳等的方法[7-8]綜合打分。按條帶的清晰度、亮度及數(shù)量從低到高賦值1～25分，對3次重復進行3次獨立計分。依據(jù)計分結果進行直觀分析，假設各因素之間不存在交互作用，計算各因素在各水平下的平均分值，以反映因素的各個水平對體系的影響程度。

1.8.2 UPGMA聚類分析 對得到的SCoT電泳條帶圖譜應用Tanon-2500系統(tǒng)GIS軟件進行分析，對圖譜中同一遷移率位置清晰出現(xiàn)的條帶賦值“1”，無條帶的賦值“0”，條帶模糊或不清晰的不予統(tǒng)計，構建“0/1”表。對所得的“0/1”表應用NTSYS-pc2.10e軟件計算其遺傳距離，對計算結果采用UPGMA算法聚類，對聚類結果構建SAHN樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

2.1.1 電泳檢測結果 由圖1可知，所有樣品均呈現(xiàn)出1條清晰的條帶，無拖尾現(xiàn)象，且無蛋白污染，表明提取到的DNA質量較好，適用于后續(xù)研究。

2.1.2 純度與濃度檢測 提取的所有樣品的DNA濃度范圍在70～187 ng/μL，D260 nm/D280 nm值均在1.8左右，說明試劑盒法能在柚類植物中提取到質量優(yōu)、純度高的DNA，符合試驗要求。

2.2 PCR正交設計結果

對凝膠圖譜(圖2)按條帶清晰程度及數(shù)量打分，3次獨立打分的平均分依次為4.00、5.33、3.67、0、0、7.67、8.67、4.67、6.37、2.00、7.00、10.00、16.33、16.67、11.67、12.00、9.00、13.67、14.67、10.33、2.67、9.67、19.33、25.00、22.33分。依據(jù)直觀分析的結果(表3)，按極差R值的大小各因素對反應體系的影響程度依次為Mg2+濃度>dNTPs濃度>引物濃度>Taq酶用量>DNA用量，其中Mg2+濃度對反應結果的影響最大，而DNA濃度則對反應結果影響最小。根據(jù)均值K，各因素各水平下均值最高的為最優(yōu)用量，則得到的最優(yōu)反應體系為3 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTPs、0.75 UTaq酶、0.4 μmol/L引物、50 ng DNA。

2.3 引物篩選及退火溫度優(yōu)化

依據(jù)優(yōu)化的最佳反應體系，以差距較大的6個樣品(A4吳川正毛、A8清湖假西洋、A9大嶺假西洋、A11廣中醫(yī)正毛、A20紅玉香柚、A25檸檬)DNA為模板，對36條引物進行篩選，得到6條(S2、S14、S15、S20、S30、S32)條帶清晰、多態(tài)性高的引物，部分引物篩選結果見圖3。對篩選到的6條引物逐一進行退火溫度篩選，在設置的9個溫度條件下選擇條帶清晰且多態(tài)性高的作為最適退火溫度。部分退火溫度篩選結果見圖4，最終得到各引物的最適退火溫度(表4)。

2.4 SCoT標記的多態(tài)性分析

利用篩選出的6條引物以最優(yōu)退火溫度條件對25份化州柚及近緣種樣品(A25檸檬樣品不計入多態(tài)性結果)進行擴增，共擴增出94條條帶，其中69條具有多態(tài)性(表4)。篩選出的每條SCoT引物平均可擴增出條帶15.67條，多態(tài)性比例55.56%～85.00%，平均多態(tài)性73.4%，表明SCoT標記在化州柚種質中擴增效率高， 化州柚及其近緣種遺傳多態(tài)性較豐富(圖5)。

表3 正交設計直觀分析結果

2.5 SCoT標記的聚類分析

將所有引物在25份樣品得到的結果轉化為“0/1”表，利用NTSYS計算其相似系數(shù)，25份試材的遺傳相似系數(shù)分布在0.600～0.992之間，以黑、灰、白3種顏色分別代表最低值、中間值、最高值，構建遺傳相似系數(shù)熱圖(圖6)。對圖6直觀分析可知，圖中數(shù)據(jù)顏色大多數(shù)較淺，表明25份試材之間相似度較高。

用UPGMA算法構建樹狀圖(圖7)，在相似系數(shù)為0.65左右時可將檸檬(A25)與柚類樣品區(qū)分，在相似系數(shù)為0.79左右時可將柚類樣品分為2個類群。所有的化州柚(A1～A11)及1份沙田柚(A12)樣品為第1個類群，在第1個類群中不同的化州柚品種沒有各自聚為一支，且與1份沙田柚(A12)同聚為一支；第2個類群中先是將沙田柚(A13、A14)聚為一支，另一分支中云南瑞麗的本地實生種紅玉香柚(A20)獨自聚為一支，不同品種和采集地的5份琯溪蜜柚(A15～A19)先聚為一支后與云南芒市的本地柚聚為一支，瑞麗的水晶柚(A23)和優(yōu)選品種大富五號(A22)聚為一支后與光青(A24)聚為一支。

3 結論與討論

本研究通過正交設計優(yōu)化了SCoT-PCR反應體系，從36條引物中篩選出6條并優(yōu)化了其退火溫度，最終擴增得到了55.56%～85.00%的多態(tài)比例，構建了適用于化州柚及其近緣種的SCoT分子標記體系。通過UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)，化州柚能夠較好地與琯溪蜜柚、水晶柚等其他柚類品種區(qū)分開，但可能由于嫁接因素，沙田柚顯示出與化州柚較近的親緣關系。不同品種的化州柚沒有很好地聚在一起，也表現(xiàn)出一定的差異，且這種差異不是由產地因素引起的，可能存在更多的化州柚品種。鳳尾與密葉親緣關系較近而與假西洋較遠，正毛則在鳳尾和假西洋中均有分布， 提示正毛和副毛的區(qū)分可能是因商品等級而非品種差異。

目前在化橘紅種質資源的研究中，已有多種分子標記顯示出較低的多態(tài)性，且不同品種的化州柚相似度高、分類困難。SCoT分子標記較好地揭示了25份化州柚及其近緣種的遺傳差異，并且擴增得到的片段多為候選功能基因，能夠進行更進一步的研究，是適用于化州柚種質資源分析的有效手段。

SCoT分子標記技術對PCR反應體系的要求較高[9]，在本試驗中發(fā)現(xiàn)，體系內各因素濃度微小的變動都有可能影響試驗結果，因此對SCoT-PCR反應體系的優(yōu)化十分必要。在化州柚種質資源的SCoT標記研究中，本試驗取得了55.56%～85.00%的多態(tài)性比例。而鄧鋒等利用ISSR標記在化橘紅種質資源研究中則獲得的多態(tài)性不夠明顯[10]，張秋鎮(zhèn)等利用AFLP標記也僅取得了5.21%的多態(tài)性[11]。從對多態(tài)性的揭示效率來看，SCoT標記可作為研究化州柚種質資源的一種有效手段。

表4 SCOT引物篩選優(yōu)化結果

本試驗所構建的UPGMA樹狀圖能夠將化州柚樣品與其他柚類樣品分開，但有1份沙田柚樣品與化州柚聚類關系較近，這可能是如今化州柚多嫁接于沙田柚上培育的結果。陳曉潁等研究發(fā)現(xiàn)，化州柚與沙田柚在ITS1序列上僅有2個堿基的差異[12]，譚婉菁等研究也發(fā)現(xiàn)，正毛和沙田柚的相似程度高，并且認為正毛和沙田柚有一定的關系[13]。而另外的2份沙田柚樣品均來自海南瓊海且聚為一支，它們在當?shù)赜?5年以上的樹齡，由于海南地理位置的特殊性，生長環(huán)境的差異可能造成了這2份沙田柚與廣東沙田柚的差別。試驗結果能夠將對照品種檸檬與柚類分開，且柚類品種如化州柚和琯溪蜜柚都能夠很好地聚類，體現(xiàn)出SCoT標記在柚類植物中分類鑒別的有效性和準確性。

針對不同品種化州柚的分析，本研究顯示出以下幾個特點：(1)同一品種的化州柚樣品沒有很好地聚為一支，但其聚類結果相對集中，鳳尾與假西洋樣品沒有混在同一小分支的情況，且同一采集地的不同品種有區(qū)分(如江湖鎮(zhèn)的鳳尾和密葉)，同一品種采集地不同也能聚為一支(如廣西和大嶺村的假西洋)；(2)本試驗中的假西洋樣品能夠聚為一類，而4個鳳尾樣品則相對分散，這可能由于鳳尾是比較古老的品種，在長期繁衍的過程中，其后代發(fā)生變異的可能性較大[14]，趙俊生等利用單核苷酸多態(tài)性(SNP)標記對不同品種化州柚的基因分型研究中也表明化橘紅種質資源可能存在更多的品系[15]；(3)筆者在化州實地采樣中了解到密葉是相對較新的品種，并且可能由鳳尾演化而來，而本試驗結果也印證了這一觀點；(4)本研究中正毛樣品被分為2支， 分別與鳳尾和假西洋表現(xiàn)出較近的親緣關系。正毛、副毛、光青是依據(jù)果實表面茸毛的多寡進行區(qū)分的，在早期是一種商品的分類方法，這種稱謂一直沿用至今。而化州柚在長時間的繁衍下，已衍生出多個品種，正毛化橘紅也可能來源于不同的品種。趙俊生等的SNP分型研究中發(fā)現(xiàn)，相同來源的正毛樣品基因型不同，卻分別與另一不同來源的正毛樣品基因型相同[15]，龐一波的研究中也得到了相似的結論[16]?；莓?shù)匾灿袑＜艺J為，正毛、副毛不應歸為化州柚的不同品種而應作為不同的商品等級，同一植株在不同環(huán)境及管理條件下都有可能呈現(xiàn)出果實茸毛的多寡，并且化州柚果實存在越成熟毛越少的特性[17]，因此同一植株的果實也可能出現(xiàn)“正毛”或“副毛”的特性。

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