胡曉莉， 蔣彩虹， 耿銳梅， 趙 強(qiáng)， 侯 爍， 張雨生， 程立銳， 楊?lèi)?ài)國(guó)， 王元英

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100193)

煙草赤星病是一類(lèi)真菌性病害，多發(fā)生于成熟期葉片，嚴(yán)重危害煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。該病害于1892年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)[1]，1916年，我國(guó)首次在北京的近郊發(fā)現(xiàn)，到20世紀(jì)60年代初，開(kāi)始在河南以及山東的煙區(qū)流行。20世紀(jì)80年代以來(lái)，全國(guó)煙區(qū)發(fā)病有日益嚴(yán)重的趨勢(shì)[2-4]。發(fā)病初期為黃色小點(diǎn)，隨著發(fā)病時(shí)間的增加，病斑逐漸變?yōu)楹稚辽詈稚瘦喖y狀，質(zhì)脆易破，嚴(yán)重時(shí)病斑相互連接合并，葉片失去其利用價(jià)值[5-6]。近年來(lái)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，煙草赤星病每年發(fā)病面積在10萬(wàn)hm2左右，經(jīng)濟(jì)損失上億元，是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一[7-8]。因此，明確煙草赤星病病原菌類(lèi)型，進(jìn)而提出病害防治措施是降低煙區(qū)經(jīng)濟(jì)損失的重要前提。

前人的研究表明引起煙草赤星病的病原菌為鏈格孢屬真菌，且該屬中多種病菌均能引起煙草赤星病的發(fā)生。彭希文等報(bào)道了云南煙區(qū)赤星病致病菌為長(zhǎng)柄鏈格孢菌和鏈格孢菌[9]。張國(guó)輝等在貴州煙草赤星病發(fā)病區(qū)鑒定出了蕓薹鏈格孢[10]。本研究利用真菌形態(tài)學(xué)、基于rDNA-ITS序列的分子生物學(xué)方法鑒定山東部分地區(qū)煙草赤星病病原菌，以期為煙草赤星病防治和抗性機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)于2017年3—7月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙草行業(yè)基因資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)菌株主要由本課題組分離，部分菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物保護(hù)中心和青島農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。菌株地理來(lái)源信息見(jiàn)表1。

表1 病原菌菌株來(lái)源信息

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

1.2.1 菌種活化 采用8 mm打孔器沿供試菌株的菌落邊緣打取含有菌絲的菌餅，并用滅菌牙簽挑取菌餅倒置于PDA固體培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水 1 000 mL)，置于28 ℃培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)，所有菌株均培養(yǎng)4～5代，使其具有較大致病活力時(shí)再進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 (1)菌落形態(tài)觀察：活化后的菌株于 28 ℃ 黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，觀察描述菌落形狀、顏色等形態(tài)學(xué)特征。(2)孢子懸浮液制備：菌株培養(yǎng)7 d左右，待菌落鋪滿培養(yǎng)基，用移液槍移取2 mL滅菌水于培養(yǎng)基，輕輕刮取菌落，并用2層滅菌醫(yī)用脫脂紗布過(guò)濾掉菌絲體，留取孢子懸浮液，采用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整其濃度約為1×106個(gè)/mL。(3)分生孢子觀察與測(cè)量。采用上述配制好的孢子懸浮液制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的產(chǎn)孢類(lèi)型，分生孢子的形狀、橫縱隔膜數(shù)等形態(tài)學(xué)特征。每個(gè)菌株選擇21個(gè)分生孢子，用標(biāo)尺測(cè)量40×放大倍數(shù)分生孢子的長(zhǎng)寬，統(tǒng)計(jì)測(cè)量數(shù)據(jù)，并按顯微鏡標(biāo)尺計(jì)算分生孢子實(shí)際值。計(jì)算方法如下：實(shí)際值 (μm)=10 μm×測(cè)量值(cm)/2.4 cm。

1.3 分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 DNA提取 挑取菌絲，移到含有50 mL PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于220 r/min的28 ℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng) 7 d，用2層滅菌醫(yī)用脫脂紗布對(duì)菌絲體溶液進(jìn)行過(guò)濾，收集菌絲體，利用真菌DNA提取試劑盒(Omega Bio-Tek，美國(guó))提取各菌株的DNA，放于-20 ℃冰箱待用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增及回收測(cè)序 rDNA-ITS擴(kuò)增所需引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR擴(kuò)增體積為30 μL：其中Hifi superMixⅡ 13 μL、ITS1(10 μmol/L)1 μL、ITS4(10 μmol/L)1 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 13 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。利用TaKaRa凝膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，連接到Peasy-blunt載體，轉(zhuǎn)入5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 序列分析 利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)定的12株菌株的ITS序列進(jìn)行多重比對(duì)，分析不同菌株間的核苷酸差異性。然后將不同類(lèi)別菌株的ITS序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)Blast與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)，初步確定病原菌類(lèi)型。

1.3.4 構(gòu)建進(jìn)化樹(shù) 以本試驗(yàn)初步鑒定結(jié)果為基礎(chǔ)，在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中下載已報(bào)道的常見(jiàn)鏈格孢屬真菌ITS區(qū)序列數(shù)據(jù)，利用MUSCLE程序?qū)Ω麈湼矜呔鶬TS區(qū)的核酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，基于比對(duì)結(jié)果利用MEGA 6.0軟件采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，檢驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)

2.1.1 菌落形態(tài) 12株病原菌于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，形成圓形或近圓形菌落。菌落鋪展于培養(yǎng)基，呈絨氈狀。其中A1菌株菌落呈米白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，邊緣較整齊，生長(zhǎng)均勻，分生孢子為卵形，灰黑色。A2、A10菌株菌落呈輪狀生長(zhǎng)，邊緣不整齊，中間凹，邊緣氣生菌絲發(fā)達(dá)呈灰色，中間菌絲不發(fā)達(dá)呈墨綠色。A3、A5、A6、A7、A9菌株氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌落呈輪狀生長(zhǎng)，中間凹呈墨綠色，邊緣有白色環(huán)帶，邊緣較整齊。A4、A11菌株培養(yǎng)初期，菌落顏色泛綠色，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌落顏色逐漸變?yōu)榛液谏?，邊緣生長(zhǎng)不整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)，邊緣生長(zhǎng)整齊。A8、A12菌株菌落呈輪狀生長(zhǎng)，內(nèi)部呈白色，外部呈灰黑色，邊緣生長(zhǎng)整齊(圖1)。

2.1.2 分生孢子 分生孢子從培養(yǎng)基表面的菌絲或氣生菌絲上產(chǎn)生，直立單生，表面光滑，顏色為棕色或深褐色，形狀呈卵圓狀、梨狀、棒狀。分生孢子的橫隔膜數(shù)為2～5個(gè)，縱隔膜為0～3個(gè)，分生孢子的大小為(5.00～20.83) μm×(0.83～8.33) μm，孢子梗突出，長(zhǎng)度為0.83～5.00 μm(表2)。通過(guò)形態(tài)學(xué)研究表明本研究12株赤星病菌株的鏈格孢屬形態(tài)特征明顯，其菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)、產(chǎn)孢類(lèi)型等特征，與張?zhí)煊钤凇吨袊?guó)真菌志(第16卷 鏈格孢屬)》[11]中對(duì)鏈格孢屬真菌形態(tài)特征的描述相符，說(shuō)明本試驗(yàn)所研究的12株供試菌株均為鏈格孢屬真菌。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

利用ITS1/ITS4真菌通用引物，對(duì)提取的12株菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，均擴(kuò)增出了目的片段，片段大小570 bp左右。采用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多重比對(duì)，其中A5、A6、A9、A10、A11、A12這6個(gè)菌株的ITS序列一致，同源性達(dá)到100%。

表2 菌株分生孢子特征值

與這6株菌株的ITS序列對(duì)比，A1、A4、A8菌株均與其有單個(gè)核苷酸的差異，其中A1在起始位多出1個(gè)堿基T，A4菌株在 46 bp 處存在A與G的堿基差異，A8菌株在 493 bp 處存在C與T的堿基差異；A3和A7菌株均與其有2個(gè)核苷酸的差異，分別在271 bp、520 bp處存在G與A、T與C的堿基差異，150、201 bp處存在G與A、G與T的堿基差異；A2菌株與其有3個(gè)核苷酸的差異，分別在571、572、573 bp 處多出A、A、G 3個(gè)堿基(圖3)。表明A5、A6、A9、A10、A11、A12菌株可能屬于相同的種，A1、A2、A3、A4、A7、A8菌株可能屬于不同的種或同一種的不同生理小種。

DNAMAN軟件比對(duì)后，將具有差異菌株的ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，A3、A4、A7菌株與Alternariasp.的同源性為99%，只能鑒定到鏈格孢屬，而未能鑒定到種。A1、A2菌株分別與登錄號(hào)為KM458821、KU182490的鏈格孢菌Alternariaalternata的同源性為100%。A5、A6、A9、A10、A11、A12菌株與登錄號(hào)為KY788021的鏈格孢菌Alternariaalternata同源性為100%，初步確定此8株菌株為鏈格孢菌Alternariaalternata。A8菌株與Alternariatenuissima(登錄號(hào)：HQ402558)的同源性為100%，初步確定該菌株為細(xì)極鏈格孢菌(表3)。以本研究的初步鑒定結(jié)果為基礎(chǔ)，構(gòu)建出了基于rDNA-ITS序列的常見(jiàn)鏈格孢屬真菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。

表3 菌株序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

世界上已報(bào)道的鏈格孢菌共有500多個(gè)種，95%以上的種類(lèi)可寄生于多種作物上，引起作物病害[12]。其中引起煙草赤星病病害的病原菌主要為Alternariaalternata、Alternarialongipes、Alternarianicotianae[9，13-14]。本研究收集到來(lái)自山東諸城、即墨、高密3個(gè)地區(qū)的赤星病病原菌12株，通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS區(qū)段序列分析，結(jié)果表明來(lái)自3個(gè)地區(qū)的病原菌A1、A11、A2、A5、A6、A9、A10、A12均初步鑒定為Alternariaalternata，沒(méi)有表現(xiàn)出區(qū)域差異性，這一結(jié)果與康業(yè)斌、陳瑞泰等認(rèn)為的河南省煙草赤星病菌為Alternariaalternata[15-16]、關(guān)博元鑒定的重慶煙區(qū)的赤星病菌為Alternariaalternata[14]具有相似性。此外，本研究在諸城煙區(qū)初步鑒定到了Alternariatenuissima可引起煙草赤星病的現(xiàn)象，與耿莉娜等初次在重慶煙草赤星病發(fā)病區(qū)鑒定到Alternariatenuissima[17]具有一致性，說(shuō)明鏈格孢屬中的Alternariatenuissima也可能是煙草赤星病的主要致病菌。

目前，對(duì)真菌病原菌的鑒定主要有形態(tài)學(xué)鑒定法和分子生物學(xué)鑒定法[18-19]。祖艷青等利用形態(tài)學(xué)鑒定法將河南省煙草赤星病病原菌鑒定為3個(gè)種，分別是鴨梨鏈格孢Alternariayaliinfciens、鏈格孢Alternariaalternata、長(zhǎng)柄鏈格孢Alternarialongipes[20]。該方法主要以病原菌菌落形態(tài)及分生孢子形態(tài)為依據(jù)，但病原菌形態(tài)易受到培養(yǎng)基種類(lèi)、光暗時(shí)間、溫度條件等環(huán)境因素的影響，變化幅度較大，準(zhǔn)確鑒定到種較困難。分子生物學(xué)鑒定方法的出現(xiàn)為真菌病原菌的鑒定提供了更為科學(xué)、準(zhǔn)確、高效的技術(shù)手段。其中ITS序列是公認(rèn)的真菌分子鑒定的首選序列[21]，該序列以其進(jìn)化速率快，有豐富的變異、信息位點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于屬內(nèi)種間及居群間分子系統(tǒng)演化關(guān)系的鑒別[22-23]，2012年胡中會(huì)等利用ITS序列分析的方法確定云南煙區(qū)赤星病病原菌為小孢子種[24]，本研究利用該方法初步確定12株病原菌的類(lèi)型為Alternariasp.、Alternariaalternata、Alternariatenuissima。隨著分子鑒定方法的不斷探究和日臻完善，rDNA-ITS序列分析將會(huì)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，具有較大的發(fā)展空間和應(yīng)用價(jià)值。

本研究通過(guò)對(duì)山東部分地區(qū)煙草赤星病病原菌鑒定的試驗(yàn)研究，結(jié)果表明引起山東部分地區(qū)煙草赤星病的病原菌組成至少有2個(gè)種，分別為鏈格孢菌(Alternariaalternate)和細(xì)極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)，其中鏈格孢菌Alternariaalternata為煙草赤星病主要致病菌。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pearson R C，Hall D H. Factors affecting the occurrence and severity of blackmold of ripe tomato fruit caused byAlternariaalternata[J]. Phytopathology，1975，65(12)：1352-1359.

[2]孔凡玉，朱賢朝. 我國(guó)煙草侵染性病害發(fā)生趨勢(shì)原因及防治對(duì)策[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，1995(1)：31-34.

[3]宋利民. 我國(guó)赤星病發(fā)生流行規(guī)律調(diào)查研究[J]. 煙草科技，1994(3)：40-42.

[4]張濟(jì)能，龐鄉(xiāng)林，李慶義，等. 煙草赤星病流行因素及其防治[J]. 中國(guó)煙草，1992(3)：28-30.

[5]杜 雷，張 樂(lè)，高智謀，等. 安徽煙草赤星病菌生物學(xué)特性及致病力分化研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2009，15(1)：39-43.

[6]張世才. 重慶煙草赤星病菌的致病力分化及遺傳差異性研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2009.

[7]易 龍，肖崇剛. 重慶煙草赤星病菌致病力分化及培養(yǎng)性狀研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003，16(3)：34-37.

[8]張萬(wàn)良，翟爭(zhēng)光，謝揚(yáng)軍，等. 煙草赤星病研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23(1)：122-124.

[9]彭希文，劉光珍，楊永柱，等. 云南省煙草赤星病(tobacco brown spot)病原研究及其防治藥劑的篩選[J]. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，22(2)：153-156.

[10]張國(guó)輝，陶 敏，張文華. 畢節(jié)市白菜黑斑病的病害研究及病原鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(19)：11477-11479.

[11]張?zhí)煊? 中國(guó)真菌志(第16卷 鏈格孢屬)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2003：187-203.

[12]Farr D F，Bills G F，Chamuris G P，et al. Fungi on plants and plant products in the United States[M]. St. Paul，Minn，USA：APS Press，1989.

[13]成巨龍，安德榮. 陜西煙草赤星病的病原鑒定[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997(3)：18-19.

[14]關(guān)博元. 重慶煙草赤星病菌種級(jí)地位及致病力分化研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2007：1-57.

[16]康業(yè)斌，成玉梅，郭合營(yíng). 豫西地區(qū)煙草侵染性病害調(diào)查分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995(2)：17-20.

[16]陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，等. 全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)煙省(區(qū))煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，1997，18(4)：1-7.

[17]耿莉娜，帥 紅，趙 敏，等. 重慶巫溪煙區(qū)煙草赤星病病原鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(8)：181-183.

[18]張弛成，吳偉懷，粱艷瓊，等. 王草莖點(diǎn)霉葉斑病病原鑒定及生物學(xué)特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(6)：210-214.

[19]張國(guó)輝，王 龍，任永權(quán)，等. 藥用植物太子參3種病害的病原鑒定與病害分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44(7)：177-179.

[20]祖艷青，蔣士君，王海濤，等. 河南省煙草赤星病病原鑒定[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2013，19(4)：73-77.

[21]Bellemain E，Carlsen T，Brochmann C，et al. ITS as an environmental DNA barcode for fungi：an in silico approach reveals potential PCR biases[J]. BMC Microbial，2010，10：189.

[22]de Hoog G S，Horre R. Molecular taxonomy of theAlternariaandUlocladiumspecies from humans and their identification in the routine laboratory[J]. Mycoses，2002，45：259-276.

[23]張 榮，岳海梅，孫廣宇. 小孢子鏈格孢OPA2-1核苷酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育研究[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2009，28(4)：553-557.

[24]胡中會(huì)，趙立華，嚴(yán)恩平，等. 云南煙草赤星病菌及近似種 rDNA-ITS序列分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(5)：670-676.