周 勇，李凈瓊，李 嘉，毛瑞文，謝 嬌，劉亞西，江千濤，蒲至恩，譚 志，王際睿,3

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所, 四川成都 611130； 2.成都海關(guān)/食品安全檢測四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川成都 610041；3.作物基因資源與遺傳改良國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 四川成都 611130)

穗發(fā)芽(Pre-harvest sprouting, PHS)是指作物成熟未收獲前，籽粒在穗上發(fā)芽的現(xiàn)象[1]。小麥穗發(fā)芽現(xiàn)象與種皮顏色具有特定的相關(guān)性[2]。小麥種皮有多種顏色，如白色、紅色、棕色、紫色等，生產(chǎn)上以白皮小麥和紅皮小麥為主。其中，白皮小麥因其皮薄且胚乳相對(duì)含量及出粉率高，較紅皮小麥更受農(nóng)戶和企業(yè)青睞。但白皮小麥更易發(fā)生穗發(fā)芽[2]，在成熟期遇到陰雨天氣往往會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，使其在收獲季多雨的地區(qū)推廣困難。因此，當(dāng)務(wù)之急是篩選并培育具有穗發(fā)芽抗性的白皮小麥品種。

對(duì)于白皮抗穗發(fā)芽種質(zhì)資源的挖掘始于20世紀(jì)90年代。江登陽等[3]從269個(gè)普通小麥材料中篩選出涪陵須須白麥等發(fā)芽率在10%以下的6個(gè)中國白皮小麥材料。Morris等[4]研究發(fā)現(xiàn)，RioBlanco是一個(gè)高抗穗發(fā)芽白皮小麥材料。張海峰等[5]鑒定到9個(gè)發(fā)芽率在20%以下的白皮小麥材料，包括豐產(chǎn)3號(hào)、ID80-115、ID83-196、Vakka、B/V-3、B/V-5、ID83-3、Ford和Peck。蔣國梁等[2]對(duì)48個(gè)白皮小麥的休眠和穗發(fā)芽抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，涪陵須須麥、永川白麥子、遂寧坨坨麥、梓潼女兒麥和宜賓白麥子休眠期超過6周，穗發(fā)芽抗性較好。肖世和等[6]篩選出20個(gè)高抗穗發(fā)芽的白皮小麥材料，如萬縣白麥子、遂寧坨坨麥、永川白麥子以及涪陵須須麥等。Graybosch等[7]從美國種質(zhì)資源庫中篩選出一個(gè)高抗穗發(fā)芽的白皮小麥品種Nuplains。上述研究表明，從白皮小麥資源中選擇抗穗發(fā)芽品種是可行的，但近年來對(duì)白皮小麥抗穗發(fā)芽資源進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選的研究開展得較少。

小麥穗發(fā)芽是受多基因和環(huán)境因素共同調(diào)節(jié)的數(shù)量性狀[6, 8-9]。目前，己在小麥全基因組的21條染色體上挖掘到上百個(gè)抗穗發(fā)芽位點(diǎn)(QTLs)[3-4]，主要集中在3號(hào)染色體同源群[10-16]以及4A染色體上[17-23]。3號(hào)染色體同源群定位到的候選基因或者QTL位點(diǎn)中，包括一個(gè)與種皮顏色相關(guān)的重要候選基因 myb10[24]。4A染色體上的主效QTL位點(diǎn) QPhs.dpivic-4A.1與種皮顏色無關(guān)，其連鎖標(biāo)記Xgwm397和Xbarc170可以在不同的作圖群體以及生態(tài)環(huán)境下同時(shí)鑒定到[25]。隨著對(duì)白皮小麥抗穗發(fā)芽工作的關(guān)注度不斷加強(qiáng)，從白皮材料中也定位到一些與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的QTL區(qū)段[11,15,20,26]，其連鎖的分子標(biāo)記包括傳統(tǒng)的SSR標(biāo)記及高通量的DArT[20]、GBS[27]和SNP[21]標(biāo)記。利用已報(bào)道抗穗發(fā)芽連鎖標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，培育抗穗發(fā)芽品種是防治穗發(fā)芽災(zāi)害的有效途徑[28]，如Xiao等[29]利用小麥3A染色體上與穗發(fā)芽抗性連鎖的SSR分子標(biāo)記Xbarc57、Xbarc310和Xbarc321，結(jié)合傳統(tǒng)育種，成功選育出白皮抗穗發(fā)芽品種中麥911；Hickey等[25]利用 QPhs.dpivic-4A.1的連鎖SSR分子標(biāo)記Xbarc170從休眠品種AUS1408與無休眠品種后代中選擇到抗穗發(fā)芽白皮小麥材料。

本研究搜集來自世界主要小麥產(chǎn)區(qū)的555個(gè)小麥種質(zhì)資源(502個(gè)白皮種質(zhì)、53個(gè)深色種質(zhì))，在7個(gè)不同環(huán)境條件下進(jìn)行穗發(fā)芽抗性鑒定和評(píng)價(jià)，旨在篩選具有穗發(fā)芽抗性的白皮小麥材料，為育種家提供抗穗發(fā)芽白皮小麥種質(zhì)資源；同時(shí)，對(duì)白皮小麥穗發(fā)芽抗性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選與白皮小麥穗發(fā)芽抗性連鎖的SSR標(biāo)記，為白皮小麥抗穗發(fā)芽標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究所用材料包括世界主要小麥產(chǎn)區(qū)的502個(gè)白皮小麥及53個(gè)深色小麥材料(對(duì)照材料，包括紅皮、紫皮、黑皮、藍(lán)皮、灰皮和褐皮小麥)，均由美國農(nóng)業(yè)部種子資源庫提供，現(xiàn)保存于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥研究所種質(zhì)資源庫。502個(gè)白皮小麥材料包括主推栽培品種、地方品種、育種材料和遺傳材料，來源廣泛(Fehorri 25031 Kazak和Ak-Bidaj來源地資料缺失)，覆蓋全球六個(gè)洲(圖1)。

1.2 田間種植

555個(gè)供試材料于2011年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(E1)，2012年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(E2)、成都校區(qū)溫江試驗(yàn)基地(E3)和都江堰校區(qū)試驗(yàn)基地(E4)，2013年種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(E5)、成都校區(qū)溫江試驗(yàn)基地(E6)和崇州現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)基地(E7)。雙行種植，行長1.5 m，行距0.25 m，每行15株，株距0.1 m，正常田間管理。

1.3 小麥穗發(fā)芽表型鑒定

于小麥蠟熟期(穗部落黃)，收取田間麥穗。每份材料隨機(jī)取5～10個(gè)單株，每個(gè)單株取3～5穗，于通風(fēng)、避免陽光照射環(huán)境下陰干7 d，手工脫粒并于-20 ℃條件下保存以保持其休眠特性[30]。每份材料隨機(jī)抽取150粒種子，經(jīng)雙氧水滅菌處理后采用培養(yǎng)皿發(fā)芽法進(jìn)行穗發(fā)芽抗性鑒定[31-32]。每份材料均檢測3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒。發(fā)芽以露白為標(biāo)準(zhǔn)，每天記錄發(fā)芽數(shù)，連續(xù)記錄7 d后計(jì)算發(fā)芽率(germination rate，GR)。發(fā)芽率計(jì)算公式如下：

GR=(X1+X2+X3+X4+X5+X6+X7)/50×100%

X1～X7分別表示第1天到第7天的發(fā)芽數(shù)。

圖1 502個(gè)白皮小麥材料的來源分布Fig.1 Distribution of 502 white grained wheat accessions across the world

1.4 基因型鑒定

2013年，于小麥三葉期，取成都校區(qū)溫江試驗(yàn)基地所種植小麥的幼嫩葉片，采用改良CTAB法[33]提取其基因組總DNA。用核酸蛋白測定儀(Thermo Scientific，NANODROP ONE)檢測DNA純度與濃度，并將其稀釋至80 ng·μL-1，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本研究搜集到已報(bào)道與小麥穗發(fā)芽抗性位點(diǎn)相關(guān)的SSR分子標(biāo)記236對(duì)，并從GrainGenes 2.0(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)查詢標(biāo)記位置、引物序列和PCR條件。利用30個(gè)穗發(fā)芽抗性差異較大的白皮小麥材料進(jìn)行標(biāo)記篩選，選擇有差異的分子標(biāo)記并從502個(gè)材料中選擇生育期差別較小且具有代表性的303個(gè)白皮小麥材料用于后續(xù)試驗(yàn)。PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括Buffer 2.5 μL、dNTPs(200 μmol·L-1) 2 μL、上下游引物(2 mmol·L-1)各0.5 μL、1.5 UTaqplus DNA polymerase 0.1 μL、50 ng·L-1基因組總DNA 1 μL、無菌水19.4 μL。所需試劑由北京天根生化公司提供。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性1 min，52～60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸1～5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5～10 min。

采用8%的聚丙烯胺凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。讀帶方式采用多態(tài)型標(biāo)記讀法，同一個(gè)標(biāo)記不同的等位位點(diǎn)，分別加不同數(shù)字以示區(qū)分，如Xgwm397有3個(gè)不同等位位點(diǎn)，分別標(biāo)記為 Xgwm937.1 、 Xgwm937.2 、 Xgwm937.3。對(duì)每個(gè)標(biāo)記所有等位位點(diǎn)進(jìn)行讀數(shù)，若某材料中無該等位位點(diǎn)目標(biāo)片段，則將該等位位點(diǎn)在對(duì)應(yīng)材料中記錄為帶型0；反之，若有該等位位點(diǎn)目標(biāo)片段，則將該等位位點(diǎn)在對(duì)應(yīng)材料中記錄為帶型1。所有原始結(jié)果拍照留檔并記錄于Excel表格中。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel對(duì)穗發(fā)芽數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)；采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行相關(guān)性[34]及方差分析；采用Structure 2.3.4軟件中的Bayesian聚類法(Bayesian clustering algorithm)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)[35-37]；采用TASSEL 3.0軟件中的混合線性模型(Mixed linear model)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析[38-39]，該模型將同時(shí)控制群體結(jié)構(gòu)[35]和親緣關(guān)系[40]；采用Excel、R軟件(R version 3.0.3)[41]及ggplot2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白皮小麥穗發(fā)芽抗性鑒定結(jié)果

相關(guān)性分析結(jié)果(表1)表明，不同環(huán)境下發(fā)芽率相關(guān)系數(shù)較低，除2012年溫江試驗(yàn)基地及2013年雅安校區(qū)農(nóng)場、溫江試驗(yàn)基地、崇州現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)基地的發(fā)芽率與2012年都江堰校區(qū)試驗(yàn)基地的發(fā)芽率顯著相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.63、0.63、0.76和0.60，P<0.01)外，其余環(huán)境之間的相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。此外，方差分析結(jié)果(表2)表明，2012年雅安校區(qū)農(nóng)場的發(fā)芽率與其余6個(gè)環(huán)境下的發(fā)芽率差異均達(dá)到顯著水平(P<0.01)，2012年溫江試驗(yàn)基地與2013年雅安校區(qū)農(nóng)場、崇州現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)基地及2013年雅安校區(qū)農(nóng)場與溫江試驗(yàn)基地的發(fā)芽率差異也達(dá)到顯著水平(P<0.01)。說明白皮小麥穗發(fā)芽抗性受環(huán)境影響大。

白皮小麥和深色小麥材料均在2011年雅安校區(qū)農(nóng)場檢測到最低的平均發(fā)芽率，分別為76.29%和50.51%，均在2013年雅安檢測到最高的平均發(fā)芽率，分別為92.13%和76.90%，白皮小麥材料的總平均發(fā)芽率為85.58%，深色小麥材料的總平均發(fā)芽率為65.57%(表3)。方差分析結(jié)果表明，白皮小麥平均籽粒發(fā)芽率顯著高于深色小麥(F=61.94,Fcrit=3.86,P-value=1.87E-14)，說明穗發(fā)芽抗性與小麥籽粒顏色相關(guān)。

通過對(duì)502個(gè)白皮小麥材料在7個(gè)不同環(huán)境下的平均發(fā)芽率分析發(fā)現(xiàn)，僅1.39%的材料7個(gè)具有較強(qiáng)的穗發(fā)芽抗性，其平均發(fā)芽率在40%以下，74.7%的材料375個(gè)易穗發(fā)芽，其平均發(fā)芽率在80%～100%之間(圖2)。其中，Osiris的平均發(fā)芽率最低(7.61%)，在7個(gè)不同的環(huán)境下發(fā)芽率均低于10%，為供試白皮小麥里最強(qiáng)且最穩(wěn)定的抗穗發(fā)芽材料，也是7個(gè)代表性抗穗發(fā)芽材料中唯一的地方品種(表4)。Vilmorin 29和Miana的平均發(fā)芽率分別為14.01%和15.82%，這兩份材料在不同環(huán)境中也相對(duì)穩(wěn)定，發(fā)芽率均在10%～20%之間(表4)。Kanto 107、Darwin、Magnif MG和Benefactress的平均發(fā)芽率分別為22.05%、31.72%、33.50%和36.84%，但這4個(gè)材料的穗發(fā)芽抗性易受環(huán)境影響(表4)。Kanto107在2012年溫江試驗(yàn)基地和2013年崇州現(xiàn)代化基地鑒定中發(fā)芽率只有2%，但在2012年雅安校區(qū)農(nóng)場鑒定結(jié)果中高于40%；Darwin在2012年雅安點(diǎn)鑒定中發(fā)芽率只有7.50%，但在2012年溫江點(diǎn)鑒定中可達(dá)61.93%；Magnif MG在2013年溫江點(diǎn)鑒定中發(fā)芽率只有11.72%，但在2013年崇州點(diǎn)鑒定中可達(dá)67.91%；Benefactress在2012年溫江點(diǎn)鑒定中發(fā)芽率只有6.05%，但在2013年溫江點(diǎn)鑒定中高達(dá)68.76%(表4)。

表1 白皮小麥在7個(gè)不同環(huán)境下發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficient of germination rates of white grained accessions in 7 environments

E1：2011年雅安；E2：2012年雅安；E3: 2012年溫江；E4：2012年都江堰；E5：2013年雅安；E6：2013年溫江；E7：2013年崇州；**表示在0.01水平上顯著相關(guān)。下同。

E1：Ya’an in 2011; E2：Ya’an in 2012；E3: Wenjiang in 2012；E4：Dujiangyan in 2012；E5：Ya’an in 2013；E6：Wenjiang in 2013；E7：Chongzhou in 2013; ** indicated the correlation is significant at 0.01 level. The same below.

表2 白皮小麥在7個(gè)不同環(huán)境間發(fā)芽率的方差檢驗(yàn)(F值)Table 2 Variance analysis of germination rates of white grained accessions in 7 different environments(F value)

**表示差異在0.01水平上顯著。

** indicated the difference was significant at 0.01 level.

表3 白皮小麥和深色小麥在7個(gè)不同環(huán)境下穗發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Statistical analysis of germination rates of white grained and colorful grained accessions in 7 different environments %

**表示差異在0.01水平上顯著。

** indicated the difference was significant at 0.01 level. WGW: White grained wheat; CGW: Colorful grained wheat.

供試材料中，除Fehorri 25031 Kazak和Ak-Bidaj來源地不確定外，其余500個(gè)均有明確的地理來源。本研究通過分析平均發(fā)芽率，以洲為單位比較不同來源地的白皮小麥穗發(fā)芽抗性差異(圖3)。其中，來源于歐洲的白皮小麥平均發(fā)芽率最低，為76.51%；來源于南美洲的白皮小麥次之，平均發(fā)芽率為82.59%；來源于大洋洲的白皮小麥平均發(fā)芽率最高，為91.00%。多重比較結(jié)果表明，來自歐洲的材料平均發(fā)芽率顯著低于其他5個(gè)洲，穗發(fā)芽抗性最強(qiáng)，其次為南美洲，來自北美洲、亞洲、非洲和大洋洲的白皮小麥穗發(fā)芽抗性差異不顯著。

圖2 502個(gè)白皮小麥平均發(fā)芽率的樣本分布Fig.2 Sample distribution of mean germination rates of 502 white grained accessions表4 7個(gè)抗穗發(fā)芽的白皮小麥材料在不同環(huán)境下的發(fā)芽率Table 4 Germination rate of seven white grained accessions with high PHS tolerance %

-表示數(shù)據(jù)缺失。

- indicated missing values.

圖注上方不同小寫字母表示不同來源地小麥平均發(fā)芽率差異在0.05水平上顯著。

Lowercases at the top of the figure indicated the difference is significant at 0.05 level.

圖3不同來源地的白皮小麥平均發(fā)芽率比較

Fig.3Comparisonofmeangerminationratesofwhitegrainedaccessionsfromdifferentcontinents

2.2 白皮小麥遺傳結(jié)構(gòu)分析

首先，利用236對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)30個(gè)具有穗發(fā)芽抗性差異的(極端抗、易穗發(fā)芽)白皮小麥材料進(jìn)行檢測，結(jié)果篩選到71對(duì)有多態(tài)性的SSR標(biāo)記。然后，利用篩選到的71對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記對(duì)具有代表性的303個(gè)白皮小麥材料進(jìn)行基因型鑒定，共發(fā)現(xiàn)202個(gè)等位變異位點(diǎn)，其中，標(biāo)記Xbarc1004、Xbarc22、Xcfd44僅鑒定到1個(gè)等位變異位點(diǎn)，標(biāo)記Xwmc650鑒定到7個(gè)等位變異位點(diǎn)，其余標(biāo)記鑒定到的等位變異位點(diǎn)介于2到5之間(表5)。

從71對(duì)SSR標(biāo)記中鑒定到的202個(gè)等位變異位點(diǎn)，均用于303個(gè)白皮小麥群體結(jié)構(gòu)分析(圖4a)；依據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)將白皮小麥群體分為3個(gè)亞群(K=3)時(shí)，分別有40.92%、30.03%和29.04%的材料分在三個(gè)亞群中，南美洲和大洋洲材料只分為了兩個(gè)亞群，非洲、亞洲、北美洲和歐洲材料均可分為三個(gè)不同的亞群；將白皮小麥群體分為4個(gè)亞群(K=4)時(shí)，有20.46%的材料組成了新的亞群，亞洲、北美洲、歐洲、南美洲和大洋洲材料均可分出新的亞群，而非洲材料仍然保持三個(gè)亞群不變；當(dāng)K=5時(shí)，有8.58%的材料組成了新的亞群，非洲、北美洲和大洋洲材料保持不變，亞洲、歐洲和南美洲材料均可分出新亞群，說明群體結(jié)構(gòu)變化并未穩(wěn)定；當(dāng)K=6時(shí)，群體結(jié)構(gòu)趨近穩(wěn)定，小于2%的材料組成了新的亞群，除了非洲，其他五大洲材料均可見新亞群。利用Structure Harvester(http://taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/)對(duì)群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果(圖4b)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=4時(shí)為最佳群體結(jié)構(gòu)。由此可以看出，在不同的群體分層結(jié)構(gòu)下，非洲的白皮小麥群體結(jié)構(gòu)仍然單一，而來自其他地區(qū)的材料遺傳結(jié)構(gòu)更復(fù)雜。

2.3 抗穗發(fā)芽候選位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

利用236 對(duì)標(biāo)記檢測到的202 個(gè)多樣性位 點(diǎn)，結(jié)合穗發(fā)芽表型與不同的遺傳結(jié)構(gòu)，對(duì)303個(gè)白皮小麥材料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過平均發(fā)芽率與各環(huán)境下發(fā)芽率分別關(guān)聯(lián)到4個(gè)與15個(gè)等位變異位點(diǎn)(表6)，其中， Xcfd44.1可在平均發(fā)芽率和兩個(gè)不同的環(huán)境下關(guān)聯(lián)到。在總計(jì)18個(gè)等位變異位點(diǎn)中，5個(gè)位點(diǎn)( Xbarc105.2、 Xgwm261.3、 Xgwm369.1、 Xgwm369.3和 Xgwm340.3)只能在特定的群體分層中顯著關(guān)聯(lián)；2個(gè)位點(diǎn)( Xwmc537.2和 Xwmc75.1)能在3個(gè)不同的群體分層中顯著關(guān)聯(lián)；其余11個(gè)位點(diǎn)能在4個(gè)不同的群體分層(K=3、4、5和6)同時(shí)顯著關(guān)聯(lián)。說明前5個(gè)位點(diǎn)受群體分層影響較大，而后13個(gè)位點(diǎn)受群體影響較小。在這13個(gè)受群體影響小的位點(diǎn)中，有3個(gè)位點(diǎn)( Xcfd102.1、 Xcfd102.2和 Xcfd102.3)只能在發(fā)芽率平均值中顯著關(guān)聯(lián)，有5個(gè)位點(diǎn)( Xwmc537.2、 Xwmc272.2、 Xbarc347.1、 Xbarc154.1和 Xbarc172.1)只能在某一個(gè)環(huán)境下顯著關(guān)聯(lián)，而另外5個(gè)( Xwmc24.2、 Xbarc321.2、 Xwmc75.1、 Xcfd44.1和 Xgwm397.1)則可以在兩個(gè)不同的環(huán)境下顯著關(guān)聯(lián)，其中 Xcfd44.1還能在發(fā)芽率平均值中顯著關(guān)聯(lián)，這5個(gè)位點(diǎn)為穩(wěn)定且受群體分層影響較小的位點(diǎn)。 Xwmc24.2可以在2011年和2012年雅安校區(qū)農(nóng)場的表型鑒定中顯著關(guān)聯(lián)，可解釋2.29%～4.02%的表型變異， Xbarc321.2可以在2013年溫江校區(qū)試驗(yàn)基地和崇州現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)基地的表型鑒定中關(guān)聯(lián)到，可解釋6.50%～7.92%的表型變異， Xwmc75.1能在2012年雅安校區(qū)農(nóng)場和溫江校區(qū)試驗(yàn)基地的表型鑒定中關(guān)聯(lián)到，可解釋2.81%～4.55%的表型變異，這3個(gè)位點(diǎn)解釋表型變異度均不足10%，為穩(wěn)定的微效位點(diǎn)； Xcfd44.1能在2013年雅安校區(qū)農(nóng)場和溫江校區(qū)試驗(yàn)基地的表型鑒定中關(guān)聯(lián)到，可解釋8.55%～11.99%的表型變異， Xgwm397.1能在2013年溫江校區(qū)試驗(yàn)基地和崇州現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)基地的表型鑒定中關(guān)聯(lián)到，可解釋7.40%～13.02%的表型變異，這2個(gè)位點(diǎn)最大可解釋表型變異度均高于10%，且能在不同環(huán)境下關(guān)聯(lián)到，為穩(wěn)定的主效抗穗發(fā)芽位點(diǎn)；除此之外，其他關(guān)聯(lián)位點(diǎn)可能受群體分層影響較大，或者是環(huán)境之間不能穩(wěn)定重復(fù)出現(xiàn)，均為不穩(wěn)定白皮小麥抗穗發(fā)芽位點(diǎn)。

表5 71對(duì)有多態(tài)性差異的分子標(biāo)記Table 5 Seventy-one polymorphism markers

AF：非洲; AS：亞洲; AU：澳洲; EU：歐洲; NA：北美洲; SA：南美洲。a：303個(gè)白皮小麥群體結(jié)構(gòu); b：不同亞群時(shí)△K的結(jié)果。

AF: Africa; AS: Asia; AU: Australia; EU: Europe; NA: North America; SA: South America.a:Structure results of the 303 white genotypes; b：△Kresults for each sub-population.

圖4 白皮小麥資源群體結(jié)構(gòu)分析

*表示染色體及其位置來自GrainGenes 2.0(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)公共數(shù)據(jù)庫；a、b、c和d分別表示群體結(jié)構(gòu)為3、4、5和6。

* indicated the chromosome and detail position the locus belonged were collected from GrainGenes 2.0(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)；a,b,c and d indicated the number of subpopulations were 3,4,5 and 6,respectively.

3 討 論

本研究對(duì)555個(gè)普通小麥材料進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，502個(gè)白皮小麥材料在7個(gè)不同的環(huán)境下均比53個(gè)深色小麥材料的發(fā)芽率高，與前人研究結(jié)果相似。Groos等[26]認(rèn)為粒色與穗發(fā)芽抗性呈正相關(guān)，顏色越深則抗性越強(qiáng)，紅皮小麥比白皮小麥穗發(fā)芽抗性更好；巨 偉等[42]同樣認(rèn)為，種皮顏色與籽粒休眠性相關(guān)，影響不同品種的穗發(fā)芽抗性。20個(gè)國內(nèi)白皮小麥材料，如白麥子、泰山1號(hào)、江東門和白禿頭，這些材料在本研究中穗發(fā)芽抗性均較弱，與前人研究報(bào)道[43-45]相似。共篩選出7個(gè)穗發(fā)芽抗性較強(qiáng)的國外白皮小麥品種(Osiris、Vilmorin 29、Miana、Kanto 107、Darwin、Magnif MG和Benefactress),其中,Osiris為來自埃及的地方品種，其他6個(gè)材料均為育成品種(系)。Benefactress為來自英國的白皮小麥，家系組成為“Squarehead/Red King//Rough Chaff White”，其中,Red King為紅皮小麥，Rough Chaff White和Squarehead為白皮小麥，但其穗發(fā)芽抗性水平未知，故不能從表型判斷Red King的抗性來源；從關(guān)聯(lián)SSR位點(diǎn)來看，Benefactress抗性位點(diǎn)由 Xwmc24.2-1A、Xbarc105.2-2B、Xwmc272.2-2B、Xgwm261.3-2D、Xgwm397.1-4A、Xwmc537.2-5B、Xcfd102.1-5D、Xbarc347.1-5D、Xbarc172.1-7D和 Xbarc154.1-7D提供，可利用這些位點(diǎn)對(duì)親本進(jìn)行掃描，來判斷Red King的抗性來源，因此，Benefactress的抗性來源于白皮或紅皮小麥親本，還需進(jìn)一步研究。Vilmorin 29由Vilmorin 23和Allies雜交選育而成，而這兩個(gè)親本籽粒均是棕黃色，推斷其抗性位點(diǎn)與籽粒顏色相關(guān)位點(diǎn)無關(guān)。其他4個(gè)材料的系譜雖也清楚，但無法查詢親本信息或籽粒顏色信息，故不在此討論。這7個(gè)白皮抗穗發(fā)芽材料，一方面可以直接或間接的作為抗穗發(fā)芽育種親本，另一方面可以作白皮小麥抗穗發(fā)芽機(jī)理的研究對(duì)象。

關(guān)聯(lián)分析是近幾年發(fā)展起來的一種利用己存在的種質(zhì)資源研究數(shù)量性狀的新工具，可以克服傳統(tǒng)QTL定位的不足，一方面可節(jié)約人力、物力和時(shí)間，另一方面具有更高的解析率以及更多的變異，目前己普遍應(yīng)用到小麥抗穗發(fā)芽候選位點(diǎn)的研究之中[46-50]。結(jié)合7個(gè)不同環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)與71對(duì)多態(tài)性分子標(biāo)記的基因型鑒定，利用關(guān)聯(lián)分析，在白皮小麥中關(guān)聯(lián)到16對(duì)標(biāo)記的18個(gè)等位變異位點(diǎn)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)，包括5個(gè)穩(wěn)定的等位變異位點(diǎn)( Xwmc24.1-1A、 Xcfd44.2-2D、 Xbarc321.2-3A、 Xgwm397.1-4A和 Xwmc75.1-5B)，其中，位于染色體3A和4A上的候選基因已經(jīng)成功被挖掘和克隆。Liu等[51]2008年通過構(gòu)建重組自交系(RILs)，在染色體3A上定位到1個(gè)主效穗發(fā)芽QTL位點(diǎn) QPhs.pseru-3AS，與標(biāo)記Xbarc12、Xbarc321和Xbarc369緊密連鎖；Liu等[11]2010年從該重組自交系F6代中選擇2個(gè)雜合株系，通過構(gòu)建近等基因系，開發(fā)7個(gè)與目標(biāo)性狀連鎖的AFLP標(biāo)記，將QTL位點(diǎn) QPhs.pseru-3AS進(jìn)行精細(xì)定位，縮小QTL區(qū)間至1.9 cM以內(nèi)；Liu等[12]2013年利用圖位克隆的方法從 QPhs.pseru-3AS中克隆到一個(gè)與穗發(fā)芽相關(guān)基因，并命名為 TaPHS1。本研究關(guān)聯(lián)到的Xbarc32與 QPhs.pseru-3AS緊密連鎖，說明 TaPHS1也是白皮小麥抗穗發(fā)芽重要基因。與分子標(biāo)記Xgwm397連鎖的QTL位點(diǎn)phs曾在不同的研究群體中被報(bào)道過[18-23, 52-54]。Tan等[54]2006年曾利用白皮小麥AUS1408在染色體4AL上定位到標(biāo)記Xgwm397與休眠性緊密連鎖。Barrero等[22]2015年利用4個(gè)親本Yitpi、Chara、Baxter和Westonia構(gòu)建MAGIC群體，在3個(gè)不同的環(huán)境下，將染色體4AL定到1個(gè)QTL，與標(biāo)記wsnp_Ex_c66324_64493429和CD920298連鎖，位于標(biāo)記Xgwm397旁邊。通過在重組自交系F7代選出的5個(gè)株系構(gòu)建剩余雜合群體(HIF)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序分析數(shù)據(jù)(RNA-seq)，中國春測序數(shù)據(jù)作為參考(Chromosome Survey Sequence)，將目的基因定位到CSS contigs Chr4AL_7123764中，并成功克隆出ABA途徑相關(guān)基因 PM19-A1和 PM19-A2。Torada等[23]2016年也在染色體上距離 PM19基因0.3 cM處發(fā)現(xiàn)另一個(gè)休眠相關(guān)基因MAPKinaseKinase(MKK3)。說明該QTL區(qū)間可能有2個(gè)休眠相關(guān)基因。由此可見，其他三個(gè)位點(diǎn)附近也應(yīng)該有相應(yīng)的候選基因，但至今未見基因克隆或精細(xì)定位工作。本研究中關(guān)聯(lián)到的與白皮穗發(fā)芽抗性相關(guān)的SSR標(biāo)記，為白皮小麥穗發(fā)芽抗性的分子標(biāo)記選擇輔助育種提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

通過對(duì)收集自世界主要小麥產(chǎn)區(qū)的502個(gè)白皮小麥資源材料在7個(gè)不同環(huán)境下進(jìn)行穗發(fā)芽抗性評(píng)價(jià)，篩選出7個(gè)具有穗發(fā)芽抗性的白皮種質(zhì)資源，其中，4個(gè)材料來自歐洲，另外3個(gè)材料分別來自亞洲(日本)、美洲和非洲，這些材料可用于白皮抗穗發(fā)芽機(jī)理研究和白皮小麥品種穗發(fā)芽抗性改良。此外，結(jié)合穗發(fā)芽抗性表型數(shù)據(jù)與基于穗發(fā)芽抗性相關(guān)候選位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)，對(duì)具有代表性的303個(gè)白皮小麥進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在平均值與各環(huán)境值下共發(fā)現(xiàn)18個(gè)與白皮小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)的等位變異位點(diǎn)，其中， Xwmc24.2-1A、 Xcfd44.1-2D、 Xbarc321.2-3A、 Xgwm397.1-4A和 Xwmc75.1-5B能夠在不同環(huán)境中關(guān)聯(lián)到，為較穩(wěn)定的白皮小麥抗穗發(fā)芽位點(diǎn)，可以運(yùn)用到白皮小麥穗發(fā)芽抗性的分子標(biāo)記輔助選擇育種中。

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