黃貝，李龍寶，吳信潔，何周，陳子怡，姚芳，楊華,*，宛曉春*

（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230036；2 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系，安徽合肥 230036）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）和茶樹(shù)（Camellia sinensisL.）同屬于山茶科山茶屬。油茶是我國(guó)特有的木本油料物種[1]，其而其油脂代謝相關(guān)的[2-3]研究較多。茶樹(shù)作為加工各類茶飲的重要經(jīng)濟(jì)林物種，其葉片富含兒茶素類（黃烷-3醇類）次生代謝物[4]，并對(duì)茶葉品質(zhì)的形成具重要影響。最近，Tai和Jiang通過(guò)比較研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)和油茶中兒茶素類成分的積累和分布差異較大[5-6]。兒茶素類物質(zhì)的生物合成來(lái)自于植物類黃酮合成途徑[6]，Tai通過(guò)對(duì)兩個(gè)物種比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，鑒定了該途徑相關(guān)的一些差異表達(dá)基因，包括花青素還原酶基因（ANR）?；ㄇ嗨剡€原酶具有催化花青素類還原形成兒茶素的作用[7]，茶樹(shù)ANR基因（CsANR）已經(jīng)被克隆，且功能已獲得驗(yàn)證[8]，而油茶ANR基因（CoANR）尚未被克隆，其相關(guān)的功能也尚不明確。因而，本文對(duì)油茶ANR基因進(jìn)行克隆，并對(duì)其原核表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行體外酶促反應(yīng)活性的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以成年油茶樹(shù)（長(zhǎng)林四號(hào)）為實(shí)驗(yàn)材料（安徽六安，德昌苗木公司），選取長(zhǎng)勢(shì)良好一致油茶植株，采集芽、一葉、莖和根樣品，每個(gè)樣品三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

兒茶素標(biāo)品（C、EC、GC、EGC、ECG和EGCG，上海源葉標(biāo)品公司），色譜級(jí)甲酸（阿拉丁公司，中國(guó)），色譜級(jí)甲醇（TEDIA，美國(guó)），色譜級(jí)乙酸等。KOD-Fx-plus高保真酶（TOYOBO公司，日本），rTaq酶（TaKaRa公司，大連），RNA提取試劑盒，膠回收試劑盒等。

1.2 油茶花青素還原酶基因的克隆

1.2.1 RNA的提取

預(yù)先準(zhǔn)備 65℃水浴鍋和 RNase滅活的研缽。取保存在-80℃的樣品，在液氮中迅速研磨至粉末，采用TIANGEN試劑盒，按照廠家說(shuō)明書(shū)提取總RNA。

1.3 油茶ANR全長(zhǎng)基因的克隆

1.3.1 油茶ANR全長(zhǎng)基因的克隆

基于已發(fā)表的茶樹(shù)花青素還原酶基因（CsANR1和CsANR2，GenBank登錄號(hào)為ADZ58166和ADZ58168）[8]和本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的油茶轉(zhuǎn)錄組序列[7]的比對(duì)分析，鑒定了兩條同源的油茶花青素還原酶基因（CoANR1和CoANR2）的轉(zhuǎn)錄本?；谶@兩條轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步采用RACE結(jié)合嵌套PCR方法獲得CoANR1和CoANR2的5’-UTR和3’-UTR序列，測(cè)序驗(yàn)證后的片段通過(guò) MegAlign軟件比對(duì)，再用EditSeq軟件拼接獲得全長(zhǎng)序列。以O(shè)RF系列引物（CoANR1-ORF-F，CoANR1-ORF-R 和CoANR2-ORF-F，CoANR2-ORF-R）擴(kuò)增CoANR1和CoANR2完整的ORF框。相關(guān)引物見(jiàn)表1。

表1 克隆油茶花青素還原酶基因的相關(guān)引物

1.3.2 ANR基因的進(jìn)化樹(shù)分析

將CoANR1和CoANR2ORF框翻譯成氨基酸序列，用 MegAlign和 MEGA6.0軟件將CoANR1和CoANR2的氨基酸序列與植物ANR基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。采用的植物ANR蛋白包括進(jìn)化樹(shù)上縮寫(xiě)的基因物種及登錄號(hào)為：CsANR1 （茶樹(shù)，ADZ58166）， CsANR2 （茶樹(shù)，ADZ58166），AtANR（擬南芥, AT1G61720），PtANR （楊樹(shù)，XP_002317270），TcANR （可可，ADD51353），VvANR （葡萄，CAD91911）MtANR （苜蓿， AAN77735）， DkANR （柿樹(shù)，BAF56654），F(xiàn)aANR1 （草莓，ABG76843），F(xiàn)aANR2 （草莓，ABD95362），LcANR （百脈根，ABC71337）， MdANR （蘋(píng)果，AEL79860），TrANR （白三葉，ADD09575），MsANR （紫花苜蓿， ADK95116）。

1.4 CoANR1和CoANR2基因的原核表達(dá)

1.4.1 CoANR1和CoANR2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)特異性重組引物設(shè)計(jì)CoANR1-pMAL-SalI-F，CoANR1-pMAL-SalI-R 和CoANR2-pMAL-SalI-F，CoANR2-pMALSalI-R（見(jiàn)表1）。選用pMAL-c5X表達(dá)載體，先用內(nèi)切酶SalI切開(kāi)，再采用一步克隆法試劑盒（One Step Clone Kit）將測(cè)序驗(yàn)證的CoANR1和CoANR2基因和載體進(jìn)行連接，完成原核表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.4.2 CoANR1和CoANR2重組蛋白的純化

將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，挑選測(cè)序正確的單克隆菌株，加入4mL的LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)14h，擴(kuò)大成600mL培養(yǎng)體系，培養(yǎng)至OD值0.6左右，加1mM IPTG，25℃誘導(dǎo)6h，收集菌體，超聲破碎，離心獲取上清蛋白，用親和樹(shù)脂柱純化獲得CoANR1，CoANR2純化蛋白，用 BCA蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。采用 SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)和純化的蛋白。

1.4.3 CoANR1和CoANR2重組蛋白的體外酶活檢測(cè)

基于 Xie[7]和 Qian[9]的方法對(duì)花青素還原酶體外酶活反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，該反應(yīng)體系總體積100μL，包括30μg純化重組蛋白，100 μM氯化矢車菊色素（或者氯化飛燕草色素），500mM NADPH，以及pH6.5的20mM磷酸緩沖液。37℃反應(yīng)30min后用等體積甲醇終止反應(yīng)，12000rpm冷凍離心，棄下層沉淀，得到的上清經(jīng) 0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾后獲得反應(yīng)產(chǎn)物的溶液。反應(yīng)產(chǎn)物采用UPLC-MS/MS檢測(cè)，A流動(dòng)相為0.4%乙酸，B流動(dòng)相為甲醇，洗脫條件：0～5 分鐘， 5%～20%B，5～18 分鐘，20%～25%B，18～25分鐘，從25%～5%B。流速為0.2mL·min?1，檢測(cè)波長(zhǎng)278nm紫外光，進(jìn)樣量 2μL，反相柱 Kinetex1.7u XB-C18 100A column (Phenomenex 30 mm×2.1 mm)。質(zhì)譜儀檢測(cè)采用 MRM 模式（m/z 100～800），鞘氣溫度325℃，流速6L·min?1，干燥氣流溫度325℃，毛細(xì)管電壓45psi。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶ANR全長(zhǎng)基因的克隆

2.1.1 油茶不同器官總 RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè)提取的油茶不同器官總RNA經(jīng)檢測(cè)濃度較高，其A260/A280和A260/A230值表明RNA質(zhì)量較好，沒(méi)有污染（表2）。經(jīng)凝膠電泳膠檢測(cè)RNA條帶完整，沒(méi)有出現(xiàn)彌散。因此，提取的RNA質(zhì)量較好，能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

表2 油茶不同器官RNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

圖1 不同器官RNA凝膠電泳圖

2.1.2 油茶ANR全長(zhǎng)基因的克隆

通過(guò) RACE和RT-PCR結(jié)合的方法，獲得油茶CoANR1和CoANR2基因的全長(zhǎng)序列，菌落PCR的結(jié)果見(jiàn)圖2。將陽(yáng)性菌落測(cè)序，獲得 COANR1（登錄號(hào)：MG925480）全長(zhǎng) 1441bp，包括ORF框1047bp，5’UTR區(qū)188bp，3’UTR區(qū) 206bp。ORF框編碼 348個(gè)氨基酸殘基，肽鏈分子量大小 37.4KDa，等電點(diǎn) PI 為5.52；獲得COANR2（登錄號(hào)：MG925481）全長(zhǎng)1413bp，包括ORF框1014bp，5’UTR區(qū)155bp，3’UTR區(qū)244bp。ORF框編碼337個(gè)氨基酸殘基，肽鏈分子量大小36.2KDa，等電點(diǎn) PI 為 6.5。

圖2 CoANR1和CoANR2 菌落PCR檢測(cè)結(jié)果

2.1.3 ANR基因的進(jìn)化樹(shù)分析

將CoANR1和CoANR2基因與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄一些植物ANR基因的氨基酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。CoANR1和茶樹(shù)同源性為97%，和柿樹(shù)，葡萄，紫花苜蓿比對(duì)的同源性分別為97%，78%，79%，73%；CoANR2和茶樹(shù)同源性為99%，和百脈根，柿樹(shù)和蘋(píng)果的同源性分別為 99%，77%，86%，82%。進(jìn)化樹(shù)分析表明，CoANR1和CoANR2分別與茶樹(shù)CsANR1和CsANR2親緣性最高，并與柿樹(shù)、葡萄、可可和楊樹(shù)ANR在同一進(jìn)化樹(shù)分支上。

圖3 油茶與其他物種花青素還原酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.2 CoANR1和CoANR2重組蛋白的制備和體外酶活檢測(cè)

2.2.1 CoANR1和CoANR2重組蛋白的制備

含有CoANR1和CoANR2完整ORF序列的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，采用pMAL-c5X載體，基于Vazyme公司的一步克隆法構(gòu)建原核表達(dá)載體，再將表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)菌株（BL21），誘導(dǎo)表達(dá)后在大腸桿菌破碎上清中獲得重組的目的粗蛋白（見(jiàn)圖4泳道2和4），經(jīng)SDSPAGE檢測(cè)表明目的蛋白與預(yù)測(cè)表達(dá)蛋白的分子量大小一致。重組粗蛋白進(jìn)一步經(jīng)過(guò)親和樹(shù)脂純化后獲得相應(yīng)的純化重組蛋白（見(jiàn)圖4泳道3和5），經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純化蛋白雜帶較少，目的蛋白顯著富集（圖4）。

2.2.2 CoANR1和CoANR2重組蛋白體外酶活檢測(cè)

將純化后的CoANR1和CoANR2重組蛋白用于體外酶促反應(yīng)，并用LC-MS檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果表明，CoANR1和CoANR2重組蛋白都可以催化花青素還原反應(yīng)產(chǎn)生兒茶素，當(dāng)?shù)孜餅槭杠嚲丈貢r(shí)，CoANR1和CoANR2都能將其催化成C和EC；當(dāng)?shù)孜餅轱w燕草色素時(shí)，CoANR1和CoANR2都能其催化成GC和EGC（圖5）。

圖4 CoANR1和CoANR2重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)圖

圖5 CoANR1和CoANR2重組蛋白體外酶促反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測(cè)（a）底物為矢車菊色素的催化產(chǎn)物 ； (b)底物為飛燕草色素的催化產(chǎn)物

3 討論

本研究克隆了兩條油茶花青素還原酶的全長(zhǎng)基因，并對(duì)油茶重組CoANR1和CoANR2蛋白進(jìn)行體外酶活檢測(cè)。結(jié)果表明兩者均具有催化花青素轉(zhuǎn)化為兒茶素的功能。這一結(jié)果與茶樹(shù)重組 CsANR1和 CsANR2蛋白體外酶促反應(yīng)催化矢車菊色素和飛燕草色素的產(chǎn)物相同[8]。然而在Tai和Jiang[5-6]的研究中發(fā)現(xiàn)，茶樹(shù)中（尤其在幼嫩葉部）積累的總兒茶素含量顯著高于油茶[5-6]。本研究盡管發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)和油茶ANR重組蛋白體外催化功能相似，但是茶樹(shù)和油茶ANR蛋白的體內(nèi)催化功能尚不明確，有待將來(lái)進(jìn)一步研究和比較。此外，Tai通過(guò)茶和油茶葉部的比較轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)物種兒茶素合成途經(jīng)關(guān)鍵酶相關(guān)基因表達(dá)存在顯著差異，其中茶樹(shù)ANR基因表達(dá)顯著高于油茶ANR基因，基因轉(zhuǎn)錄水平的差異可能導(dǎo)致最終代謝產(chǎn)物積累的差異，但是相關(guān)的基因調(diào)控的分子機(jī)制還有待將來(lái)進(jìn)一步的深入研究。

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