王涵磊，薛繼陽，葛捍偉，夏杰，林煒，趙琦峰

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 心胸外科 兒童心臟中心，浙江 溫州 325027）

炎癥反應(yīng)過程在缺血再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）中扮演著重要角色，而炎癥反應(yīng)主要通過各種炎癥細(xì)胞發(fā)揮作用，除了中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，近年來，研究者逐步重視樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）在IRI中發(fā)揮的作[1-2]。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是一類進(jìn)化保守的模式識(shí)別受體，研究發(fā)現(xiàn)TLRs尤其是TLR4參與了IRI[3]。高遷移率族蛋白B1（high

mobility group protein box-1，HMGB1）作為炎癥的早期啟動(dòng)者和晚期促進(jìn)者，扮演著細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等角色，同樣在IRI中作用突出[4]。HMGB1是TLR4的特異性配體，可在細(xì)胞壞死或損傷后，釋放到細(xì)胞外或血清中產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)；而TLR4主要在巨噬細(xì)胞、DCs等細(xì)胞上表達(dá)。近年來，HMGB1/TLR4信號(hào)通路在IRI中的作用研究較多[5-6]，而HMGB1是否通過DCs上的TLR4調(diào)控DCs的功能，從而影響DCs在IRI中的作用尚未明確。本研究在分離、培養(yǎng)、純化骨髓DCs（mDCs）的基礎(chǔ)上，通過添加HMGB1、HMGB1特異性中和抗體、TLR4拮抗劑在細(xì)胞水平探討HMGB1/TLR4信號(hào)通路對(duì)mDCs下游分子、細(xì)胞因子及共刺激分子的影響，探討其對(duì)mDCs活化、成熟、炎癥介質(zhì)分泌的調(diào)控作用，為進(jìn)一步闡述HMGB1/TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)DCs在IRI發(fā)病中的作用奠定基礎(chǔ)，為IRI的防治提供新的思路和治療依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，平均（226±14）g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。

1.2 主要試劑 HMGB1抗體（Ab215008）購自英國Abcam公司，HMGB1特異性中和抗體（ST326052233）、對(duì)照抗體IgG（ST326058471）購自日本Shino-Test公司，TLR4受體拮抗劑（TAK-242，A3850）購自美國ApexBio公司，CD80抗體（SC-58911）、D86抗體（FITC標(biāo)記，SC-28347）、CD11c抗體（PE標(biāo)記，SC-398708 PE）、MyD88抗體（SC-74532）購自美國Santa Cruz公司，NF-κB P65抗體（10745-1-AP）、山羊抗大鼠IgG抗體（FITC標(biāo)記，SA00003-11）購自美國Proteintech公司，抗大鼠DCs OX62微球（130-090-663）、Midi-MACS磁珠分離器（130-042-302）購自德國Milt-enyi Biotec公司，IL-6（E0079r）、IL-8（Ml037351）、IL-12（E0059r）、TNF-α（E0133r）濃度測(cè)試試劑盒購自武漢伊艾博科技有限公司，RNA抽提試劑盒Ultrapure RNA Kit（CW0581）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司、反轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace-α-（FSK-100）購自上海TOYOBO公司，熒光定量PCR試劑盒SYBR Permix Ex TaqTMI I（DRR081S）購自日本TaKaRa公司。

1.3 主要儀器 麻醉機(jī)（R540增強(qiáng)型，深圳瑞沃德生命科技有限公司），小動(dòng)物呼吸機(jī)（北京泰盟科技有限公司），生物安全柜（BSC-1500 I I A2-X，濟(jì)南博科生物有限公司），電動(dòng)移液器、臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo Scientific公司），高速離心機(jī)、冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司），熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司），全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（M200 PRO，瑞士Tecan公司），低溫冰箱（MDF-382E，日本SANYO公司），熒光定量RT-PCR儀器（美國Bio-Rad公司）。

1.4 大鼠mDCs的分離、培養(yǎng)、純化與鑒定

1.4.1 mDCs的分離、培養(yǎng)：成年SD大鼠處死后浸入75%乙醇消毒5 min，無菌狀態(tài)下取后肢股骨和脛骨，剔除骨表面組織后剪開兩端，用PBS液沖洗出骨髓內(nèi)含物；清洗的懸液轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，用移液器吹打使沖洗出的內(nèi)容物充分分散，之后1500 r/min離心5 min，離心完成后，棄去上清，用4 mL PBS重懸細(xì)胞；接著用大鼠淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞；然后用含GM-CSF和IL-4的DCs完全培養(yǎng)基培養(yǎng)分離的細(xì)胞，6 h后換液去除未貼壁細(xì)胞，之后繼續(xù)培養(yǎng)，從第3天開始收集懸浮起來的細(xì)胞至第9天，將收集的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)純化操作。

1.4.2 mDCs的純化：得到的細(xì)胞懸液用一定量的PBS重懸后，充分混勻后，過200目無菌尼龍網(wǎng)篩后，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，計(jì)數(shù)完成后300×g離心10 min，棄去上清，按107細(xì)胞數(shù)用80 μL分選緩沖液的比例重懸管底的細(xì)胞。將收集好的細(xì)胞用抗大鼠Anti-DC（OX62）的磁珠孵育后過磁場(chǎng)，利用MACS磁珠分離原理陽性篩選出mDCs。之后分別用CD11c做免疫熒光染色及PE標(biāo)記的CD11c做流式檢測(cè)，鑒定純化后mDCs的純度。

1.4.3 mDCs的免疫熒光鑒定：利用DCs特異蛋白CD11c進(jìn)行檢測(cè)，一抗用兔抗大鼠CD11c抗體，二抗使用Alexa Fluor 594（紅色熒光）標(biāo)記的羊抗兔IgG，同時(shí)使用DAPI染核以確定視野中的細(xì)胞數(shù)量。顯微鏡下觀察胞漿呈紅色，代表mDCs的CD11c的表達(dá)呈陽性。陰性對(duì)照組用5% BSA代替一抗進(jìn)行孵育。

1.4.4 mDCs的流式鑒定：純化完成后細(xì)胞進(jìn)行流式樣本處理，先用無抗體孵育的細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，劃定熒光的陰性區(qū)域；再用PE標(biāo)記的CD11c抗體4 ℃孵育20 min后上機(jī)檢測(cè)，確定遷移入陽性區(qū)域細(xì)胞的百分比，以確定mDCs的純度。

1.5 分組 mDCs隨機(jī)分成5組，每組各設(shè)24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。①C組：對(duì)照組，mDCs加于RPMI l640完全培養(yǎng)基中；②H組：含有mDCs的完全培養(yǎng)基中加入HMGB1（1 μg/mL）；③H-Ab組：加入HMGB1（1 μg/mL）后30 min，再加入HMGB1特異性中和抗體（終濃度為1 μg/mL），其余同H組；④TLR4-A組：加入HMGB1（1 μg/mL）后30 min，再加入TLR4拮抗劑（終濃度為2 μg/mL），其余同H組；⑤IgG組：加入HMGB1（1 μg/mL）后30 min，再加入對(duì)照IgG抗體（終濃度為1 μg/mL），其余同H組。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 MyD88、NF-κB P65蛋白的表達(dá)：通過Western blot法檢測(cè)。將培養(yǎng)加藥完成的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基中和胰酶后，細(xì)胞裂解液裂解得到細(xì)胞蛋白。BCA法蛋白濃度測(cè)定，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，電泳結(jié)束后取出分離膠，通過轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉過夜，將封閉完成的膜用TBST清洗1次，孵育袋中加入封閉液稀釋的一抗MyD88（1∶300）、NF-κB P65（1∶300）和β-actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。最后用ECL法進(jìn)行曝光、顯影和定影。

1.6.2 MyD88、NF-κB P65基因的表達(dá)：通過RT-qPCR法檢測(cè)，用Trizol試劑按說明書提取總RNA，用無RNA酶水溶解后用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA溶液的OD260/OD280及OD260/OD230和RNA濃度，取等量的RNA溶液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄完成后用RT-qPCR反應(yīng)體系：SYBR Permix Ex TaqTMI I（2×）10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL依次加入八連管并混勻，按3000 r/min離心1 min。按CFX96 Touch Real-Time PCR程序，以95 ℃預(yù)變性20 s，然后95 ℃ 15 s、59 ℃30 s、72 ℃ 30 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增。MyD88、NF-κB P65引物見序列表1。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行校正，按2-△△CT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.6.3 細(xì)胞因子的表達(dá)：刺激結(jié)束后留取上清液，采用雙抗體夾心ELISA法，應(yīng)用ALISEI全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)量上清液中IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α的濃度。1.6.4 mDCs共刺激分子的表達(dá)：純度高于90%的mDCs行流式樣本處理后，用抗大鼠CD80抗體4 ℃孵育20 min，加PBS離心清洗細(xì)胞2次，添加FITC標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG 4 ℃孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD80信號(hào)強(qiáng)度。純度高于90%的mDCs行流式樣本處理后，用FITC標(biāo)記的抗大鼠CD86抗體4 ℃孵育20 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD86信號(hào)強(qiáng)度。CD80、CD86信號(hào)強(qiáng)度用幾何平均熒光值表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 通過大鼠后肢股骨和脛骨骨髓內(nèi)含物分離的細(xì)胞，用含GM-CSF和IL-4的DCs完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，第3天開始收集懸浮起來的細(xì)胞至第9天。早期可見培養(yǎng)板底部有半貼壁細(xì)胞，少量細(xì)胞集落形成，簇狀生長，細(xì)胞體積小，圓形，細(xì)胞無明顯突起；之后細(xì)胞體積變大，培養(yǎng)液中有更多的懸浮細(xì)胞，細(xì)胞集落散在其中，形態(tài)趨于mDCs。收集到第5天的mDCs在相差顯微鏡下觀察結(jié)果見圖1A。收集完mDCs進(jìn)行純化后相差顯微鏡下觀察結(jié)果見圖1B，純化后貼壁細(xì)胞中長梭狀的成纖維樣細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞中可看到帶小突出的細(xì)胞（mDCs）比例有所增加。每只SD大鼠經(jīng)純化后至少能獲得4×106個(gè)mDCs。免疫熒光鑒定可見mDCs的胞漿呈紅色（見圖1C），代表mDCs的CD11c的表達(dá)呈陽性，陰性對(duì)照組未見胞漿紅色表達(dá)，只見DAPI的藍(lán)色染核（見圖1D）。mDCs的流式鑒定可見純化mDCs用PE標(biāo)記的抗大鼠CD11c抗體孵育后，上流式檢測(cè)純度高于90%（見圖1E），陰性對(duì)照mDCs的純度極低（見圖1F）。2.2 HMGB1/TLR4信號(hào)通路對(duì)mDCs MyD88、NF-κB P65蛋白表達(dá)的影響 24 h、48 h、72 h，與C組比，各組MyD88、NF-κB P65蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；與H組比，H-Ab組、TLR4-A組MyD88、NF-κB P65蛋白表達(dá)均明顯下降（P＜0.01）。見圖2。

圖1 大鼠mDCs的培養(yǎng)、純化與鑒定

2.3 HMGB1/TLR4信號(hào)通路對(duì)mDCs MyD88、NF-κB P65 mRNA表達(dá)的影響 24 h、48 h，與C組相比，H組、IgG組MyD88、NF-κB P65 mRNA表達(dá)明顯升高；與H組比，H-Ab組、TLR4-A組MyD88、NF-κB P65 mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。72 h，與C組比，各組MyD88、NF-κB P65 mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；與H組比，H-Ab組、TLR4-A組MyD88、NF-κB P65 mRNA表達(dá)均明顯下降（P＜0.01）。見圖3。

2.4 HMGB1/TLR4信號(hào)通路對(duì)mDCs細(xì)胞因子表達(dá)的影響 24 h、48 h、72 h，H-Ab、TLR4-A、IgG組與C組相比，各組上清液中IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α的濃度明顯升高；H-Ab、TLR4-A、IgG組與H組相比，H-Ab、TLR4-A組這4種細(xì)胞因子表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。見圖4。

2.5 HMGB1/TLR4信號(hào)通路對(duì)mDCs共刺激分子表達(dá)的影響 24 h、48 h、72 h，與C組比，各組mDCs共刺激分子CD80、CD86表達(dá)明顯升高；與H組比，H-Ab組、TLR4-A組共刺激分子表達(dá)明顯下降（P＜0.01）。見圖5。

圖2 各組大鼠mDCs中MyD88、NF-κB P65蛋白的表達(dá)

圖3 各組大鼠mDCs中MyD88、NF-κB P65 mRNA的表達(dá)

3 討論

臟器IRI是臨床上常見的疾病，已成為阻礙各臟器相關(guān)疾病治療效果的主要難題。IRI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、涉及多種因素，其中局部和全身的炎癥反應(yīng)是其最重要的特征，各種炎癥細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等參與其中，近年來DCs在器官IRI中作用的研究逐漸增多，是影響IRI發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵致炎細(xì)胞之一，有望作為藥理學(xué)干預(yù)的靶點(diǎn)[7]，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不完全清楚。

DCs是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，未成熟DCs活動(dòng)性很強(qiáng)，能有效攝取和加工抗原，活化后可募集巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和非成熟淋巴細(xì)胞至炎癥部位發(fā)揮作用；DCs通過不同的特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制使未成熟DCs成為成熟DCs，成熟DCs則不再攝取抗原，而是表達(dá)高水平的MHC I I和共刺激分子，分泌TNF-α和IL-12等[8]，DCs不僅參與缺血后的炎癥反應(yīng)，而且影響IRI的愈合反應(yīng)[9]，在連接天然免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要作用；而且DCs調(diào)控免疫功能的作用與其成熟、活化程度以及數(shù)量密切相關(guān)[10]。

圖4 各組大鼠mDCs上清液細(xì)胞因子的濃度變化

有研究表明，DCs是早期IRI先天性免疫和獲得性免疫的核心，改變DCs功能的方法可提供新的治療機(jī)會(huì)與選擇[11-12]。然而，DCs的活化、成熟、炎癥介質(zhì)分泌的調(diào)控作用受很多因素影響，BATAL等[13]認(rèn)為DCs在IRI期間有激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的作用，并提出了通過氧化應(yīng)激激活DCs的新見解，為靶向治療IRI提供了理論依據(jù)；ZHANG等[14]的研究表明肝固有DCs與血源性DCs有著不同的作用，并指出了局部微環(huán)境在肝IRI中決定DCs功能的重要性；此外IRI時(shí)，損傷相關(guān)分子模式可刺激DCs通過模式識(shí)別受體來啟動(dòng)免疫應(yīng)答，經(jīng)復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活化和細(xì)胞死亡[15]。損傷相關(guān)分子模式是指機(jī)體自身因素發(fā)生改變（如應(yīng)激或/損傷）的細(xì)胞產(chǎn)生可識(shí)別的危險(xiǎn)信號(hào)，包括HMGB1、防御素等[16]；TLR，特別是TLR4是模式識(shí)別的必要受體[17]；HMGB1可通過TLR4信號(hào)通路促進(jìn)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答加劇臟器IRI[6，18]。

圖5 各組大鼠mDCs共刺激分子的表達(dá)

本研究在分離、培養(yǎng)、純化mDCs的基礎(chǔ)上，使用HMGB1（1 μg/mL）刺激mDCs后，MyD88、NF-κB P65基因與蛋白的表達(dá)水平增高，細(xì)胞因子IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α分泌增多，表面共刺激分子CD80、CD86表達(dá)上調(diào)。在使用HMGB1特異性中和抗體、TLR4拮抗劑后，HMGB1/TLR4信號(hào)通路的下游分子MyD88、NF-κB P65，細(xì)胞因子及共刺激分子的表達(dá)顯著下降，其中TLR4-A組的下降程度比H-Ab組更大。研究證實(shí)mDCs表面共刺激分子（CD80、CD86等）和細(xì)胞因子（IL-12、TNF-α等）的表達(dá)可以分析、鑒定DCs成熟和活化[19]。根據(jù)研究結(jié)果初步推斷HMGB1通過mDCs的TLR4發(fā)揮作用，可介導(dǎo)mDCs成熟、活化，調(diào)控炎癥介質(zhì)的分泌。因此，本研究為HMGB1/TLR4通路與DCs建立起一個(gè)新的功能（機(jī)制）聯(lián)系，初步證實(shí)了此信號(hào)通路對(duì)DCs具有正向調(diào)控的作用，拮抗HMGB1，阻斷TLR4具有負(fù)調(diào)控，為探討HMGB1/TLR4信號(hào)通路介導(dǎo)DCs在IRI發(fā)病中的作用提供了重要的理論依據(jù)。

HMGB1的積累對(duì)IRI后的臟器是有害的[20]，阻斷HMGB1是治療IRI的一種新策略[21]。然而，HMGB1不同濃度、不同刺激時(shí)間對(duì)DCs的調(diào)節(jié)作用具有雙重性[19]。此外，許多在體實(shí)驗(yàn)也表明HMGB1作用機(jī)制的復(fù)雜性，有學(xué)者認(rèn)為IRI前予以靜脈注射HMGB1，具有臟器保護(hù)作用[22]；OOZAWA等[23]發(fā)現(xiàn)心肌IRI后HMGB1表達(dá)增多，使用HMGB1處理損傷加重。大多數(shù)研究表明使用HMGB1抗體能減輕臟器IRI[24-25]；也有報(bào)道稱使用HMGB1單克隆抗體處理，會(huì)使IRI加重[21]。研究結(jié)果的不同，可能與實(shí)驗(yàn)條件、藥物使用時(shí)間、劑量及模型所處疾病狀態(tài)等有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。因此，本研究結(jié)果是在特定條件下的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，與設(shè)計(jì)條件不同的在體實(shí)驗(yàn)可能缺乏一致性。

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