陳海燕， 黃建敏， 李雪斌， 蒙蘭青， 郭燦收， 蔣勇明

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病更是中國目前的重大疾病之一。約70%的癲癇患者經(jīng)正規(guī)的AEDs治療后能控制發(fā)作，但仍有30%患者對各種AEDs不敏感而發(fā)生耐藥，發(fā)展為DRE[1]。DRE之所以治療困難，最重要的原因是發(fā)病機制不清楚，無法根據(jù)發(fā)病具體途徑和關(guān)鍵環(huán)節(jié)來確定有效治療方案或研發(fā)有效新藥物，同時缺乏DRE形成的早期生物學(xué)標志物，給臨床早期診斷帶來很大困難。

研究表明[2]，IREG1能將細胞內(nèi)無毒的三價鐵離子轉(zhuǎn)運到細胞外成為有害的二價鐵離子，使鐵離子代謝異常發(fā)生過氧化反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡或凋亡，參與DRE的發(fā)生和發(fā)展。這一觀點已經(jīng)得到了以動物模型及癲癇患者腦組織作為標本的實驗結(jié)果支持。但是目前有關(guān)IREG1與DRE的相關(guān)性以外周血作為標本的相關(guān)研究資料尚未見報道。故本研究通過檢測DRE患者外周血中IREG1基因及其蛋白的表達，來探討IREG1在DRE發(fā)病機制中的作用，并探討其作為生物學(xué)標志物的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年5月-2017 年1月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診及住院收治的癲癇患者62例。癲癇診斷參照1989年國際抗癲癇聯(lián)盟制定的癲癇和癲癇綜合征的分類標準[3]。排除標準：(1)眩暈、低血糖、暈厥等發(fā)作性疾病；(2)有進行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或占位性病變；(3)有嚴重心、肝、腎疾病患者及不規(guī)律服藥和生活不規(guī)律的患者；(4)妊娠及哺乳期婦女；(5)精神病或智力障礙患者。DRE診斷標準[1]：按照癲癇發(fā)作類型，合理選擇并正確使用至少兩種耐受性好的AEDs，經(jīng)足夠的療程及劑量治療(單藥治療或聯(lián)合用藥)，癲癇無發(fā)作未達到治療前最長發(fā)作間隔時間的3倍或1 y，即耐藥。AEDs控制良好診斷標準：符合2010年ILAE制定的“無發(fā)作”標準[1]，即選用1～2種一線AEDs正規(guī)治療，癲癇無發(fā)作長于3倍治療前最長發(fā)作間期或無發(fā)作長于1 y。根據(jù)DRE診斷標準分為耐藥組和AEDs控制良好組。其中耐藥組32例，男17，女15例，年齡7～68歲，平均年齡(30.8±15.6)歲；AEDs控制良好組30例，男12例，女18例，年齡4～62歲，平均年齡(38.8±15.6)歲。選取同期來院體檢的34名健康人作為正常組，其中男16例，女18例，年齡14～62歲，平均年齡(34.2±13.5)歲。3組在性別及年齡上的差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對象在抽血前均簽署知情同意書，此研究已通過本單位的倫理委員會批準。

1.2 主要試劑及儀器 血液RNA提取試劑盒(北京百泰克公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量擴增試劑盒(TaKaRa公司)，全血蛋白提取試劑盒(上海貝博生物有限公司)，抗IREGl一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，GAPDH、標記HRP的抗兔二抗、抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)等試劑。主要儀器有熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，PTC-200普通梯度PCR儀、蛋白電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀、全自動凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，5424R-臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，微量紫外分光光度計Nono-200(杭州奧盛儀器有限公司)等。

1.3 方 法

1.3.1 實時熒光定量PCR檢測外周血中IREG1基因的相對表達量 抽取受檢者清晨空腹靜脈血3 ml，于EDTA抗凝管中，置-80 ℃保存，以備用。實驗過程：(1)引物設(shè)計與合成：由TaKaRa生物科技有限公司設(shè)計合成，引物序列如下：IREG1上游引物：5’-AAGGGCAAGAATCCCAATTTAACTC-3’；下游引物：5’ -TTCTACATGTAACTTGCCAGGCTGA-3’； 擴增片段大?。?100 bp。GAPDH上游引物：5’-TGATGACATCAAGAAGGTGG-3’；下游引物：5’-TTACTCCTTGGAGGCCATGT -3’;擴增片段大?。?38 bp。(2)提取RNA和合成cDNA。每0.7 ml全血中加入裂解液2 ml，參照Trizol試劑盒的方法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，在冰上操作，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)總體系為20 μl。(3)檢測IREG1基因的表達：PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中SYBR Premix混合液10 μl，cDNA2 μl，上下游引物各0.8 μl，加雙蒸水至20 μl。放置熒光定量PCR儀中，循環(huán)數(shù)為40，進行擴增。采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析，計算出各樣品的目的基因的相對表達量。

1.3.2 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測患者外周血中IREG1蛋白的相對表達量 每500 μl全血樣本，加入500 μl蛋白提取液和2 μl蛋白酶抑制劑，充分混勻后離心取上清液內(nèi)含提取蛋白，BCA法蛋白定量為1.5 mg/ml，加蛋白上樣緩沖液，變性后保存。進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個泳道蛋白上樣量為20 μg，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，將蛋白條帶轉(zhuǎn)到PVDF膜上，封閉液封閉，室溫搖床震蕩1 h，孵育一抗(內(nèi)參為GADPH，目的抗體為IREG1，稀釋比例均為 1∶1000)，4 ℃搖床過夜。TBST洗膜，加入二抗(內(nèi)參為羊抗鼠，目的為羊抗兔，稀釋比例均為 1∶5000)，常溫孵育2 h，TBST洗膜后暗室曝光。使用Image J圖像處理軟件分析，將IREG1目的條帶灰度值與GADPH的灰度值相比，得出IREG1蛋白的相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR結(jié)果 耐藥組IREG1 mRNA相對表達量為(1.326±0.102)，良好組為(1.001±0.051)，正常組為(0.643±0.012)，3組間的IREG1基因相對表達水平的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=80.5，P=0.000)。經(jīng)LSD法進行兩兩比較，耐藥組顯著高于良好組(P=0.001)；而良好組又顯著高于正常組(P=0.001)(見表1、表2)。

2.2 蛋白免疫印跡結(jié)果 耐藥組IREG1蛋白相對表達量為(2.092±0.020)，良好組為(1.779±0.084)，正常組為(1.399±0.083)，3組間的IREG1蛋白相對表達水平的差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=50.06，P=0.005)。經(jīng)LSD法進行兩兩比較，耐藥組顯著高于良好組(P=0.02)；而良好組又顯著高于正常組(P=0.012)(見圖1、表3、表4)。

表1 3組 IREG l mRNA相對表達量比較

表2 3組IREG1 mRNA相對表達量多重比較

表3 3組IREG1蛋白表達量比較

表4 3組IREG1蛋白表達量多重比較

A:正常組；B:良好組；C:耐藥組

3 討 論

DRE治療效果差，容易反復(fù)發(fā)作，甚至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，結(jié)果常伴有智能障礙或神經(jīng)功能缺損癥狀，致殘率和致死率都很高，嚴重威脅了患者的身體健康和生活質(zhì)量。因此探討DRE的發(fā)病機制并尋找其耐藥性形成的早期生物學(xué)標志物，對早期診斷和確定可行有效的治療方案,避免耐藥性的發(fā)生具有十分重要的臨床意義。

IREG1是在 2000年由Donovan等[4]最先從斑馬魚中克隆出，編碼基因SLC40A1位于2號染色體上，其mRNA的5’末端非翻譯區(qū)含有一個典型的鐵反應(yīng)元件，能夠與鐵調(diào)節(jié)蛋白相結(jié)合調(diào)節(jié)鐵離子的轉(zhuǎn)運[5]。在腦內(nèi)鐵離子通過參與線粒體氧化反應(yīng)，DNA、RNA、蛋白質(zhì)和多種單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成等生物代謝過程來維持神經(jīng)細胞的功能，為此鐵離子內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是大腦功能穩(wěn)定的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)生理劑量的鐵蓄積也會誘導(dǎo)基因過度表達發(fā)生過氧化反應(yīng)誘發(fā)疾病[6]。IREG1是將鐵離子從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)向細胞外最重要的蛋白，病理情況下，IREG1 mRNA和蛋白表達增加，使細胞內(nèi)大量無毒性的三價鐵離子轉(zhuǎn)移到細胞外變?yōu)橛卸拘缘膩嗚F離子，導(dǎo)致鐵代謝紊亂，從而誘導(dǎo)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

實驗表明[7]在大鼠額葉皮質(zhì)、蛛網(wǎng)膜下腔、杏仁體注射鐵離子均能導(dǎo)致癲癇發(fā)生，均發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)有神經(jīng)元細胞丟失。Guo等[8]通過皮質(zhì)注射氯化亞鐵可成功建立外傷性癲癇動物模型，大鼠注射氯化亞鐵后出現(xiàn)癲癇發(fā)作，腦電圖表現(xiàn)出尖波、棘波、棘慢波等多種形式癲癇樣放電，病理結(jié)果顯示氯化亞鐵注射區(qū)大量神經(jīng)元缺失，膠質(zhì)細胞增生，以及異常的神經(jīng)元放電環(huán)路。實驗證實了鐵離子導(dǎo)致局部神經(jīng)細胞過度凋亡，進而導(dǎo)致癲癇的發(fā)生。 Zhang等[9]研究對癲癇患者行頭部MRI掃描，發(fā)現(xiàn)其大腦皮質(zhì)出現(xiàn)了彌漫性鐵沉積，提示異常增加的鐵離子通過脂質(zhì)過氧化途徑參與癲癇的發(fā)生。國內(nèi)學(xué)者柯賢軍等[2]通過基因芯片技術(shù)及RT-PCR方法，對35例DRE患者癲癇切除灶中IREG1 mRNA表達的研究，發(fā)現(xiàn)IREG1 mRNA在DRE患者術(shù)后腦組織中存在高表達，提示IREG1在DRE發(fā)病中起著重要的作用。以上研究均證實鐵離子代謝異常參與癲癇的形成，IREG1可以通過鐵離子代謝途徑參與癲癇的發(fā)生與發(fā)展。但這些研究以動物模型及手術(shù)切除的癲癇患者腦組織為標本，因存在取材困難、費用高、創(chuàng)傷大等不足，大大限制了臨床研究。因此，本研究通過對DRE患者與AEDs控制良好患者及健康人外周血中IREG1 mRNA及其蛋白表達的檢測來研究IREG1與DRE發(fā)病的相關(guān)性。結(jié)果顯示IREG1 mRNA及其蛋白在DRE患者外周血中均顯著高于AEDs控制良好患者及健康人。從而證實了IREG1參與DRE的發(fā)生與發(fā)展，并在耐藥機制中起重要作用。IREG1參與DRE的發(fā)病機制可能是：(1)IREG1將無毒的三價鐵離子從細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞外成為有毒的二價鐵離子[10]，二價鐵離子與過氧化氫、分子氧等作用而產(chǎn)生自由基，過量的自由基攻擊脂類、DNA和蛋白質(zhì)，引起細胞發(fā)生嚴重的氧化損傷，誘導(dǎo)組織損傷[11]。(2)蓄積的二價鐵離子通過誘導(dǎo)炎性細胞因子生成的途徑引發(fā)神經(jīng)元的損傷，如催化脂質(zhì)過氧化花生四烯酸釋放、前列腺素的啟動和白三烯級聯(lián)作用等引起神經(jīng)元變性、死亡[12]。(3)細胞外過多的二價鐵離子還可以通過誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白生成的途徑進一步引發(fā)神經(jīng)元的損傷，如激活細胞外信號傳導(dǎo)激酶(ERK)，影響骨架蛋白tau的磷酸化[13]，導(dǎo)致神經(jīng)元形態(tài)改變及突觸重構(gòu)，誘導(dǎo)苔蘚纖維芽生，形成異常興奮性網(wǎng)絡(luò)，促進DRE的發(fā)生和發(fā)展。(4)IREG1參與DRE的發(fā)病還可能與銅藍蛋白 (ceruloplasmin，CP)的表達異常有關(guān)。CP可氧化二價鐵離子成為三價鐵離子，只有三價鐵離子才能與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合被腦組織攝取，當缺乏CP，IREG1單獨無法發(fā)揮血腦屏障鐵轉(zhuǎn)運的功能[14]。Zou X等[15]的實驗發(fā)現(xiàn)在皮下注射鐵螯合劑(去鐵胺)，可有效控制氯化亞鐵誘導(dǎo)癲癇模型大鼠癲癇癥狀發(fā)作，顯著降低癲癇模型大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元線粒體內(nèi)的鐵沉積，減輕線粒體氧化應(yīng)激損傷的程度，減少神經(jīng)元死亡。提示調(diào)控鐵代謝紊亂可有效控制癲癇發(fā)作，即調(diào)控IREG1過度表達，有望成為DRE治療新藥開發(fā)的一個新靶點。

綜上所述，本項目研究發(fā)現(xiàn)IREG1基因及其蛋白在DRE患者外周血中表達明顯增加，推測正是這種高表達才使細胞內(nèi)大量無毒性的三價鐵離子轉(zhuǎn)移到細胞外變?yōu)橛卸拘缘膩嗚F離子，導(dǎo)致鐵代謝紊亂發(fā)生過氧化反應(yīng)從而誘導(dǎo)癲癇的發(fā)生與發(fā)展，同時提示IREG1可作為預(yù)測癲癇耐藥的外周生物學(xué)指標之一。

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