馬 翠，陳雅琳，白天鴿，魏 虹

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，新疆 石河子 832002)

白血病是一類起源于造血干細(xì)胞的克隆性惡性血液疾病，其中急性白血病比慢性白血病多見(約5.5 ∶1)，我國白血病發(fā)病率為2.76/10萬，呈逐年上升趨勢。阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Ara-C)屬于細(xì)胞S增殖期的嘧啶類抗代謝藥物，通過抑制細(xì)胞DNA的合成，干擾細(xì)胞的增殖，是目前國際公認(rèn)的抗急性髓系白血病的標(biāo)準(zhǔn)治療之一。由于其骨髓抑制、血液不良反應(yīng)、肝臟損害等毒副作用及耐藥性的出現(xiàn)，使得高劑量化療藥物的使用受限，而且單一化療也已經(jīng)不能滿足臨床需要。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展千變?nèi)f化，是多因素、多基因參與的復(fù)雜過程，綜合多方面治療是目前腫瘤治療的主要研究方向。

姜黃素(curcumin，CUR)因其具有選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞、對(duì)正常細(xì)胞毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，近年來越來越受到腫瘤治療領(lǐng)域的重視。盡管已有研究表明，CUR及其衍生物能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡[1-2]、自噬[3]、抑制白血病細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移[4]及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥[5]，且CUR既能逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌分子靶向藥物耐藥作用[6]，也可聯(lián)合5-氟尿嘧啶優(yōu)化結(jié)直腸癌細(xì)胞的治療[7]，以及協(xié)同白消安誘導(dǎo)提高KG1a細(xì)胞凋亡作用[8]。但目前并無CUR聯(lián)合Ara-C用于急性髓系白血病KG1a細(xì)胞的研究。本實(shí)驗(yàn)通過CUR誘導(dǎo)KG1a細(xì)胞自噬、凋亡，并與小劑量化療藥物Ara-C聯(lián)合，觀察對(duì)KG1a細(xì)胞增殖、自噬、凋亡的影響，進(jìn)一步探討自噬與凋亡之間的聯(lián)系，以期減少Ara-C在臨床應(yīng)用中的不良影響，為臨床白血病的聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清、碘化丙啶、吖啶橙、CUR、Ara-C均購自美國Sigma公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)購自美國APE×BIO公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(Solarbio公司)；細(xì)胞周期試劑盒(Beyotime公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；β-actin鼠單抗、caspase-3兔單抗、LC3A/B兔單抗、Bcl-2兔單抗、Beclin1兔單抗，均購自美國Cell Signaling Technology公司。CUR和3-MA用DMSO配制成儲(chǔ)存液，Ara-C用PBS配制成儲(chǔ)存液于-20℃冰箱保存，應(yīng)用時(shí)RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋到相應(yīng)終濃度。

1.1.2細(xì)胞株 人急性髓系白血病細(xì)胞株KG1a購自廣州賽庫生物技術(shù)有限公司。KG1a細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.1.3儀器 全光柵酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(杭州安杰思公司)；超微量核酸蛋白測定儀(北京凱奧公司)；流式細(xì)胞儀(Mindray公司)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測急性髓系白血病KG1a細(xì)胞增殖 將5×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長期的KG1a細(xì)胞接種于96孔板，每孔180 μL。按照實(shí)驗(yàn)分組(CUR:20、40、60、80 μmol·L-1; Ara-C:0.02、0.1、0.5、2.5 μmol·L-1)進(jìn)行操作，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，20 μL的5 g·L-1MTT溶液避光在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，終止培養(yǎng)，棄上清。每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，490 nm檢測各孔的OD值。計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)：IR=[(OD值陰性對(duì)照組-OD值空白對(duì)照組)-(OD值實(shí)驗(yàn)組-OD值空白對(duì)照組)]/(OD值陰性對(duì)照組-OD值空白對(duì)照組)×100%。

1.2.2吖啶橙法觀察自噬泡的形成 1×106個(gè)細(xì)胞接種至24孔板，藥物處理后，置37℃、5% CO2及飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，孵育后，在24、48 h分別取出細(xì)胞，PBS洗滌，加1 μL的吖啶橙染液，避光染色20 min后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×106個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中，藥物處理48 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌1遍后，每組各加100 μL結(jié)合液、2 μL FITC、2 μL PI，避光反應(yīng)20 min后，上流式細(xì)胞儀檢測。同理在24 h后收集上述各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，按照周期檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測細(xì)胞周期。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR提取各組細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書獲得cDNA，PCR反應(yīng)體系：10.0 μL SYBR Select Master Mix (2×)，2.0 μL cDNA模板，上、下游引物各0.8 μL，加水至總體積為20.0 μL。95℃ 1 min；95℃ 10 s，60℃ 34 s，35循環(huán)；60℃ 1 min。引物序列見Tab 1。以2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Sequences of primers

1.2.5Western blot檢測凋亡及自噬蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長期的KG1a細(xì)胞，細(xì)胞分組，在37℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)48 h后，RIPA裂解液提取總蛋白，每個(gè)泳道上蛋白樣品30 μg，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5% BSA的PBST溫箱中封閉1 h，洗滌1次后，分別加入對(duì)應(yīng)一抗(β-actin、caspase-3、LC3A/B、Bcl-2、Beclin-1，均1 ∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次10 min；加入山羊抗兔IgG抗體孵育1 h。曝光拍照分析。

2 結(jié)果

2.1CUR和Ara-C對(duì)細(xì)胞生長的影響如Fig 1所示，CUR在48 h的IC50為42.01 μmol·L-1，在不同的處理時(shí)間上，隨著CUR濃度的增加，其對(duì)KG1a細(xì)胞的抑制作用明顯增強(qiáng)(P<0.01)，即抑制率與劑量呈明顯正相關(guān)(R=0.723)。隨著CUR處理細(xì)胞時(shí)間的延長(24～72 h)，其對(duì)細(xì)胞的抑制作用明顯增加(P<0.05)，即抑制率與時(shí)間呈正相關(guān)(R=0.573)。表明CUR對(duì)KG1a細(xì)胞有一定的時(shí)間、劑量依賴性。同時(shí)Ara-C也對(duì)KG1a細(xì)胞有一定的時(shí)間、劑量依賴性。在此選擇CUR 40 μmol·L-1與Ara-C 0.5 μmol·L-1聯(lián)用，在處理細(xì)胞48 h后，如Fig 2所示，聯(lián)用組細(xì)胞抑制率高于各單藥組，經(jīng)3-MA預(yù)處理的各組細(xì)胞抑制率明顯增加且高于各自單用組，差異有顯著性(P<0.01)。各組均與對(duì)照組有明顯差異(P<0.01)。

Fig 1 Anti-proliferation effect of CUR(A) and Ara-C(B) on KG1a cells by MTT

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsadjacent low concentrations at the same time;△P<0.05,△△P<0.01vstime (24 hvs48 h, 48 hvs72 h)

Fig 2 Effect of different drug groups on the growth of KG1a cells after 48

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs3-MA 10 mmol·L-1pretreatment group;△P<0.05,△△P<0.01vs40 μmol·L-1CUR+0.5 μmol·L-1Ara-C group

2.23-MA抑制姜黃素誘導(dǎo)的KG1a細(xì)胞自噬如Fig 3所示，陽性實(shí)驗(yàn)組(饑餓組)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)大量酸性囊泡，在藥物作用24、48 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞質(zhì)中的酸性囊泡不斷增加，且含自噬囊泡的細(xì)胞也在增加，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生了改變。CUR 40 μmol·L-1與Ara-C 0.5 μmol·L-1聯(lián)合處理細(xì)胞后的含酸性囊泡細(xì)胞個(gè)數(shù)及單個(gè)細(xì)胞中酸性囊泡數(shù)均明顯增多，但在3-MA預(yù)處理下，每組細(xì)胞內(nèi)的自噬囊泡相對(duì)減少。

2.33-MA增強(qiáng)CUR、Ara-C或合用組對(duì)KG1a細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用藥物處理48 h后，聯(lián)合處理組較CUR和Ara-C組凋亡率明顯升高，均高于對(duì)照組(P<0.05，除了CUR組與對(duì)照組沒有顯著性差異)。3-MA預(yù)處理后的聯(lián)合處理組、CUR或Ara-C組的細(xì)胞凋亡明顯上升，均分別高于其單用組，差異有顯著性(P<0.01)。自噬抑制劑3-MA單獨(dú)處理細(xì)胞凋亡率達(dá)到(16.48±0.06)%，明顯高于對(duì)照組(Fig 4、5)。

2.4細(xì)胞周期分布情況如Fig 6所示，CUR和Ara-C分別作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞主要被阻滯在G0/G1期。0.5 μmol·L-1Ara-C組細(xì)胞與空白組比較，G0/G1期細(xì)胞明顯增多(P<0.01)，G2期細(xì)胞則明顯減少(P<0.01)；40 μmol·L-1CUR組與空白組比較，G0/G1期增多、S期和G2期則明顯減少(P<0.05)。

Fig 3 Acridine orange detecting the autophagy after the drug treatment of 24, 48 h(×400)

Fig 4 Comparison of apoptosis rate of KG1a cells in different treatment groups

A:Control; B:CUR 40 μmol·L-1+Ara-C 0.5 μmol·L-1; C: CUR 40 μmol·L-1; D: Ara-C 0.5 μmol·L-1; E: 3-MA 10 mmol·L-1; F: 3-MA 10 mmol·L-1+CUR 40 μmol·L-1; G: 3-MA 10 mmol·L-1+Ara-C 0.5 μmol·L-1; H: 3-MA 10 mmol·L-1+CUR 40 μmol·L-1+Ara-C 0.5 μmol·L-1.

2.5凋亡及自噬蛋白的表達(dá)如Fig 7所示，KG1a細(xì)胞經(jīng)處理48 h后，聯(lián)合組的caspase-3和裂解片段的相對(duì)表達(dá)量均高于單獨(dú)作用組，且與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.01)；經(jīng)3-MA預(yù)處理的40 μmol·L-1CUR組caspase-3表達(dá)低于CUR單用組(P<0.01)?？沟蛲龅鞍譈cl-2因表達(dá)量過低未檢測出。聯(lián)合組自噬標(biāo)志蛋白Beclin-1表達(dá)高于單藥組，且較對(duì)照組明顯升高，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化上升，0.5 μmol·L-1Ara-C與40 μmol·L-1CUR的聯(lián)合處理組出現(xiàn)明顯的自噬反應(yīng)。在3-MA預(yù)處理后，40 μmol·L-1CUR組Beclin-1和LC3蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。

2.6CUR與Ara-C聯(lián)合對(duì)caspase-3、Bcl-2、LC3、Beclin-1基因表達(dá)的影響如Fig 8所示，藥物處理48 h后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Bcl-2基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)，CUR+Ara-C組Bcl-2 mRNA低于單獨(dú)組(P<0.01)，在3-MA預(yù)處理下，CUR組Bcl-2 mRNA較單獨(dú)CUR組降低(P<0.05)。caspase-3與Bcl-2基因表達(dá)變化正好相反，聯(lián)用組高于單用組，3-MA預(yù)處理組高于CUR單獨(dú)組(P<0.05)。Beclin-1和LC3的基因表達(dá)水平均與對(duì)照組有明顯差異(P<0.05)，CUR+Ara-C組Beclin-1 mRNA表達(dá)量明顯高于單用組，經(jīng)3-MA預(yù)處理后的CUR組明顯降低(P<0.05)。而LC3的基因表達(dá)變化沒有顯著性差異。

Fig 5 Effect of drugs on KG1a cell 8)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vs3-MA 10 mmol·L-1pretreatment group;△P<0.05,△△P<0.01 vs 40 μmol·L-1CUR+0.5 μmol·L-1Ara-C group

Fig 6 Effects of CUR and Ara-C on cell cycle distribution of the acute myeloid leukemia KG1a

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAra-C G0/G1phase;△△P<0.01vsCUR G0/G1phase

Fig 7 KG1a cells were treated with CUR and Ara-C for 48 h, and the expression of Beclin-1, caspase-3 and LC3 proteins were analyzed by Western

1:Control 0 μmol·L-1; 2: Ara-C 0.5 μmol·L-1; 3: CUR 40 μmol·L-1+3-MA 10 mmol·L-1; 4: CUR 40 μmol·L-1; 5: Ara-C 0.5 μmol·L-1+ CUR 40 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAra-C+CUR group;△P<0.05,△△P<0.01 vs CUR 40 μmol·L-1.

Fig 8 The mRNA expression of caspase-3, Bcl-2, Beclin-1 and LC3 in KG1a cells treated with CUR and Ara-C for 48

1:Control; 2:Ara-C 0.5 μmol·L-1; 3: CUR 40 μmol·L-1+3-MA 10 mmol·L-1; 4:CUR 40 μmol·L-1; 5:Ara-C 0.5 μmol·L-1+CUR 40 μmol·L-1.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsAra-C+CUR group;△P<0.05,△△P<0.01vsCUR 40 μmol·L-1.

3 討論

急性髓系白血病是常見惡性腫瘤之一，治療主要依靠骨髓移植，但化療是其常見的輔助治療手段，由于Ara-c等化療藥物的不良反應(yīng)及其耐藥性，導(dǎo)致治療效果不理想，影響患者預(yù)后。因此，如何能在減少化療藥物的劑量和機(jī)體傷害的情況下，提高化療藥物的療效是許多研究的目標(biāo)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，CUR既能逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌分子靶向藥物耐藥作用[6]，也可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞[7]、KG1a細(xì)胞[8]、白血病K562細(xì)胞[3]等凋亡與自噬。

腫瘤的發(fā)生過程受多種因素影響，不同藥物對(duì)不同腫瘤的抗腫瘤活性不同。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，一方面自噬使細(xì)胞免受惡劣環(huán)境的傷害，另一方面是一種有別于凋亡的Ⅱ型程序性死亡或自噬性死亡[9]。細(xì)胞自噬是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，在生長因子、DNA損傷等條件下，均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。Beclin-1、LC3是參與自噬過程的兩個(gè)主要蛋白，CUR聯(lián)合Ara-C處理發(fā)現(xiàn)Beclin-1和LC3均比單一處理組表達(dá)量明顯升高，說明CUR能上調(diào)Ara-c對(duì)細(xì)胞的自噬活性。自噬抑制劑3-MA能夠抑制CUR誘導(dǎo)的KG1a細(xì)胞自噬。細(xì)胞凋亡是生物體發(fā)生、發(fā)展過程中的自然現(xiàn)象，它是由相關(guān)基因主導(dǎo)的程序性死亡方式。本實(shí)驗(yàn)中CUR聯(lián)合Ara-C處理組的caspase-3和激活片段的表達(dá)量高于CUR單獨(dú)處理組，而抗凋亡基因Bcl-2則相反。流式細(xì)胞儀檢測呈現(xiàn)相似的結(jié)果，3-MA抑制自噬促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這與有關(guān)報(bào)道一致，如在白血病細(xì)胞株中，抑制自噬能達(dá)到更好的藥物效果[10-12]，細(xì)胞自噬也能引起白血病細(xì)胞的抗藥性[13]。

Beclin-1蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域能與Bcl-2蛋白結(jié)合，抑制其促進(jìn)自噬的活性[14]，Bcl-2的減少同時(shí)也減少了與Beclin-1的結(jié)合，削弱抑制自噬的作用，因此增加了細(xì)胞自噬的活性和凋亡的發(fā)生。Beclin-1不僅參與自噬的起始，而且能與Bcl-2通過相互作用，介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。CUR聯(lián)合Ara-c處理組中的Bcl-2明顯低于單一組，代表自噬激活的Beclin-1和LC3基因表達(dá)上升，然而Bcl-2基因的下調(diào)代表凋亡率的增加，在3-MA存在的情況下，Beclin-1和Bcl-2的下調(diào)代表自噬活性的降低，并誘發(fā)凋亡的產(chǎn)生。自噬和凋亡的關(guān)系復(fù)雜多變，已有過他們關(guān)系的研究[15]。但對(duì)KG1a細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，3-MA預(yù)處理后的細(xì)胞凋亡率明顯增高，但3-MA預(yù)處理組的蛋白實(shí)驗(yàn)又顯示其凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá)量并不高于CUR單用組，這可能是3-MA造成的半胱天冬酶依賴性死亡，其功能與它對(duì)自噬的抑制無關(guān)。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，CUR能夠增加KG1a細(xì)胞對(duì)Ara-C的敏感性和凋亡，也會(huì)誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生。但是此自噬作用起到部分保護(hù)細(xì)胞免受化療藥物損傷的作用，我們可以將自噬抑制劑與凋亡誘導(dǎo)劑聯(lián)用，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，為以后臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。

總之，CUR能明顯提高KG1a細(xì)胞對(duì)Ara-C的敏感性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬，通過自噬產(chǎn)生耐藥，3-MA抑制自噬能夠增強(qiáng)藥物抗腫瘤的療效與促凋亡作用。聯(lián)合使用自噬抑制劑與凋亡誘導(dǎo)劑可能是治療白血病用藥的新方向。

(致謝：對(duì)石河子大學(xué)組織胚胎教研室、新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的全體老師和工作人員的全力支持表示衷心的感謝。)

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