紫杉醇對肝癌細胞HepG2和大鼠原代培養(yǎng)肝細胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的研究

徐雅玲，梁 菁

(廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院健康評估教研室，廣西 柳州 545006)

紫杉醇作為廣西特色抗腫瘤中藥，已成為世界公認的強活性廣譜抗癌藥物。研究表明，其對多種腫瘤細胞具有抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用[1-3]。據(jù)報道，大多數(shù)抗癌藥物在取得療效的同時，常出現(xiàn)不同程度的毒副作用[4]。而本研究組在前期已經(jīng)證實紫杉醇具有自身毒副作用，即在一定的質(zhì)量濃度和長時間作用下，對肝細胞有細胞毒作用[5]。目前，臨床上已運用紫杉醇注射液治療肝癌。然而，這類藥物對腫瘤細胞的特異性差，毒性反應(yīng)較大，易產(chǎn)生耐藥性，這些缺陷對于臨床的治療帶來了極大不便[6]。為了探索紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的影響，本研究以肝癌細胞HepG2和原代肝細胞為研究對象，通過細胞形態(tài)學(xué)、細胞活性和細胞凋亡檢測等來比較分析紫杉醇對這兩種細胞的毒性作用。初步探討紫杉醇對兩種細胞的凋亡影響，為探索其抗肝癌作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 肝癌細胞株HepG2購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.1.2實驗動物與試劑 SD大鼠♂，3只, 體質(zhì)量(50±5)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。DMEM高糖培養(yǎng)基(DMEM-HG)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)、膠原蛋白酶，均購自美國Gibco公司；紫杉醇購自黃石李時珍藥業(yè)集團武漢李時珍藥業(yè)有限公司，批號：國藥準字H20058368；Hoechst 33258測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司； Annexin-V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染試劑盒、MTT購自碧云天公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma公司。

1.1.3儀器 CKX41SF型倒置相差顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；水套式CO2恒溫培養(yǎng)箱，Shellab(SL)公司產(chǎn)品；臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；752N紫外分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；MK3 Multiskon型酶標儀，美國Thermo Labsystems公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡，德國 Leica公司產(chǎn)品；流式細胞儀，美國BD LSRFortessa公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1肝癌細胞HepG2培養(yǎng) 在37℃電熱恒溫水浴箱中快速解凍肝癌細胞HepG2，而后將肝癌細胞HepG2培養(yǎng)于含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基(含100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素和200 mol·L-1谷氨酰胺)中，放置在37℃、5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并進行細胞傳代。

1.2.2原代肝細胞培養(yǎng) 斷頭處死SD大鼠，無菌分離肝組織后均在冰浴下操作，4℃ PBS充分洗滌肝組織后，剝離肝被膜，機械剪切成1 mm3左右的組織小塊，加入0.1%的膠原蛋白酶消化5 min，盡可能輕柔的吹散膨松絮狀組織塊，充分洗滌后，加入10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，重懸靜置3 min，棄上段1/3液體，取中下層細胞懸液種瓶，置于37℃、5% CO2飽和濕度細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)肝細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，取對數(shù)生長期的細胞進行傳代擴增，用于后續(xù)實驗。

1.2.3紫杉醇溶液制備 紫杉醇用DMSO助溶(DMSO終體積分數(shù)為0.1%)配制為10 mg·L-1的母液，-20℃儲存?zhèn)溆?。實驗前，用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需終濃度分別為5、10、20、40、80 μg·L-1。

1.2.4MTT法檢測紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的毒性 將肝癌細胞HepG2和原代肝細胞制備成單細胞懸液，接種于96孔板，每孔200 μL (1×104細胞/孔)，用200 μL PBS液填充邊緣孔。待細胞生長24 h后，將兩類細胞的實驗分別分為3組，即空白組、陰性對照組、紫杉醇組(n=5)。空白組為含10% FBS的DMEM-HG培養(yǎng)液。陰性對照組為含與實驗組等量細胞的細胞懸液。紫杉醇組加入終濃度為5、10、20、40、80 μg·L-1的紫杉醇。以上3組分別培養(yǎng)24、48、72 h后，各孔加入5 g·L-1的MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，各孔加入150 μL DMSO，放置在搖床上低速震蕩10 min，待紫色結(jié)晶物充分溶解后，置于檢測波長為490 nm的酶標儀上檢測吸光度值(optical density，OD)。分別計算紫杉醇對以上兩類細胞的抑制率和24、48、72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)，確定藥物最適作用濃度和時間。抑制率/%=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%。以上實驗重復(fù)3次。

1.2.5Hoechst 33258熒光染色法觀察肝癌細胞HepG2和原代肝細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 取出蓋玻片浸泡于75%的乙醇中，30 min后酒精燈過火滅菌。滅菌好的蓋玻片置于6孔板內(nèi)。將肝癌細胞HepG2和原代肝細胞分別制備成單細胞懸液，以4.5×108·L-1接種于6孔板。待細胞培養(yǎng)24 h后，將以上兩類細胞分別分為2組：陰性對照組與紫杉醇組(n=5)。陰性對照組在含10% FBS的DMEM-HG培養(yǎng)液中培養(yǎng)；紫杉醇組加入終濃度為5、10、20、40、80 μg·L-1的紫杉醇，藥物處理24 h后, 棄去各孔培養(yǎng)液，PBS液充分洗滌3遍，取出蓋玻片放入玻璃皿，浸泡于丙酮中固定30 min。PBS液洗3遍，每次2 min，避光加入1 mL Hoechst 33258染色液，染色15 min。吸棄染色液，PBS液洗3遍，每次5 min。封片，紫外光激發(fā)波長約340 nm，發(fā)射波長約460 nm，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞周期的影響 取肝癌細胞HepG2和原代肝細胞分別制備成單細胞懸液，細胞濃度為4.5×108·L-1，800 r·min-1離心10 min，收集細胞。用4℃的PBS緩沖液重懸細胞，并緩滴4℃無水乙醇，PBS與無水乙醇的比例為3 ∶7，每隔15 min搖1次，固定2 h。以800 r·min-1離心10 min，收集細胞。加入4℃ PBS液重懸，洗滌離心沉淀2次，然后向細胞沉淀中加入150 μL PI染液，4℃避光染色30 min，上流式細胞儀，檢測各周期的百分率。

1.2.7流式細胞術(shù)檢測紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞凋亡的影響 將肝癌細胞HepG2和原代肝細胞分別制備成單細胞懸液，離心收集細胞，加入Binding Buffer 100 μL重懸細胞，然后依次加入Annexin-V-FITC和PI染液各5 μL，輕柔吹打混勻，室溫避光染色15 min，再加入Binding Buffer 450 μL吹打混勻，上流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的增殖抑制作用Fig 1的MTT結(jié)果顯示，紫杉醇(5、10、20、40、80 μg·L-1)組分別處理肝癌細胞HepG2和原代肝細胞24、48、72 h后，對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞增殖均有抑制作用，與陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且紫杉醇對肝癌細胞HepG2的抑制效果明顯高于原代肝細胞。肝癌細胞HepG2的抑制率隨著紫杉醇濃度的增加和作用時間的延長而明顯增高；相同紫杉醇濃度下不同時間的抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。紫杉醇對肝癌細胞HepG2的抑制作用具有濃度時間依賴性，對于原代肝細胞呈現(xiàn)出濃度依賴性，但無時間效應(yīng)關(guān)系。

2.2紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞凋亡形態(tài)的影響紫杉醇(5、10、20、40、80 μg·L-1)分別處理肝癌細胞HepG2和原代肝細胞24 h后，Hoechst 33258染色后，在倒置熒光顯微鏡下觀察到對照組肝癌細胞HepG2和原代肝細胞分布均勻，呈淡藍色；而紫杉醇分別作用兩組細胞后，可見細胞核呈折光性強的亮藍色小點、細胞核濃染、形態(tài)不規(guī)則，呈半月形或者圓形，可見到凋亡小體。隨著紫杉醇濃度增高，凋亡細胞數(shù)量增多，表明紫杉醇可濃度依賴性誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2和原代肝細胞凋亡。且紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2凋亡能力高于原代肝細胞(Fig 2)。

2.3紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞周期的影響紫杉醇作用肝癌細胞HepG2和原代肝細胞24 h均能改變細胞周期，與陰性對照組相比，均能提高G2/M期細胞比例(P<0.05)，且阻滯作用隨著藥物濃度的增加而增強。紫杉醇能明顯提高肝癌細胞HepG2 G2/M 期比例，G0/G1期細胞比例降低(P<0.05)，S期細胞變化不大(P>0.05)。見Fig 3。

2.4紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞凋亡的影響不同濃度紫杉醇分別作用肝癌細胞HepG2和原代肝細胞24 h后，均能誘導(dǎo)兩種細胞發(fā)生凋亡。流式細胞術(shù)結(jié)果見Tab 1，兩組相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可知，紫杉醇誘導(dǎo)兩種細胞凋亡的程度不同，紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2凋亡率明顯高于原代肝細胞，且隨著紫杉醇濃度的增高，細胞的凋亡率逐漸增加。

Tab 1 Comparison of apoptotic rates between HepG2 cells and hepatocytes treated by different concentrations

*P<0. 05vsHepG2 group

Fig 1 Inhibitory effects of paclitaxel on HepG2 cells (A) and hepatocytes(B) at 24 h, 48 h and 72

*P<0.05vscontrol group(24 h);△P<0.05vscontrol group(48 h);#P<0.05vscontrol group(72 h)

Fig 2 Effect of paclitaxel on apoptosis morphology of HepG2 cells and hepatocytes(×200)

A：Control group of hepatocytes;B：Hepatocytes injured by paclitaxel 20 μg·L-1for 24 h; C：Hepatocytes injured by paclitaxel 80 μg·L-1for 24 h;D：Control group of HepG2 cells;E：HepG2 cells injured by paclitaxel 20 μg·L-1for 24 h;F：HepG2 cells injured by paclitaxel 80 μg·L-1for 24 h.

Fig 3 Effect of paclitaxel on cell cycle of HepG2 cells and

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 討論

紫杉醇是廣西特色抗腫瘤中藥，具有廣譜抗癌活性。目前已廣泛應(yīng)用于治療乳腺癌、肝癌、肺癌等[7-8]。周艷等[9]研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在殺死癌細胞的同時，也會損害正常人體細胞，造成不良反應(yīng)甚至死亡。本研究小組前期的實驗結(jié)果與上述報道一致。由于肝細胞癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率連續(xù)攀升，已成為廣西居民健康頭號殺手[10-11]。為此，如何最大程度的發(fā)揮紫杉醇抗癌作用且使藥物的毒副作用降到最低，是目前研究的熱點問題。

本研究通過一定濃度梯度紫杉醇(5、10、20、40、80 μg·L-1) 分別培養(yǎng)肝癌細胞HepG2和原代肝細胞24、48、72 h，對其抑制增殖及其凋亡作用進行了對比研究。MTT結(jié)果表明，紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞增殖均有抑制作用，且紫杉醇對肝癌細胞HepG2的抑制效果明顯高于原代肝細胞。同時我們觀察到紫杉醇對肝癌細胞HepG2的抑制作用具有濃度時間依賴性，這與吳裕文等[12]報道紫杉醇對人肝癌HepG2細胞的生長具有明顯的抑制作用，且具有濃度依賴性的結(jié)果一致。孫煒等[13]也報道了紫杉醇能明顯抑制人肝癌HepG2細胞的生長，呈明顯量效關(guān)系。而對于原代肝細胞，隨著紫杉醇質(zhì)量濃度增高，抑制率逐漸增高，呈現(xiàn)出濃度依賴性，但無時間效應(yīng)關(guān)系。

Hoechst 33258染色觀察紫杉醇對兩種細胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)兩種細胞都可出現(xiàn)凋亡小體，細胞核呈折光性強的亮藍色小點、細胞核濃染、形態(tài)不規(guī)則，呈半月形或者圓形。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，紫杉醇可使肝癌細胞HepG2和原代肝細胞阻滯于G2/M期，改變了肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的周期，且隨著紫杉醇濃度的增高，G2/M期細胞所占比例也隨之升高。有研究表明，紫杉醇抑制腫瘤細胞的分裂及增殖，使腫瘤細胞同步為G2/M期，從而發(fā)揮抗癌作用[14]。以上實驗結(jié)果表明，紫杉醇抑制肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的增殖是通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯完成的。同時，還發(fā)現(xiàn)紫杉醇可以誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2和原代肝細胞發(fā)生凋亡。但對兩種細胞凋亡的程度不同，紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細胞HepG2凋亡率明顯高于原代肝細胞，且隨著紫杉醇濃度的增高，細胞的凋亡率逐漸增加。由此可推測，紫杉醇對于抑制肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的增殖抑制作用，和改變細胞周期比例及促進細胞凋亡的作用相關(guān)。有研究認為，肝癌細胞增殖的抑制和癌細胞周期的改變以及誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生凋亡是目前抗肝癌的一種治療手段[15]。另外，我們可以觀察到相同濃度下，紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的凋亡率差異較大。猜測紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的作用基因或者信號途徑可能存在差異性，如果可以區(qū)分紫杉醇在對這兩種細胞凋亡過程中的差異，便利于在臨床上更好的運用這類藥物，能夠最大限度發(fā)揮其作用，有效減少或者消除自身毒副反應(yīng)，增加紫杉醇抗癌效果，從而提高臨床療效。這是我們后期研究的方向。

本實驗證實了紫杉醇對肝癌細胞HepG2和原代肝細胞的毒性作用的確存在差異性，此差異性為紫杉醇在腫瘤防治的研究方面具有重要的意義。另外，本研究從細胞周期阻滯方面初步探索了紫杉醇抑制肝癌細胞增殖及自身毒副作用肝細胞損傷的機制，以期為紫杉醇臨床用藥提供可靠的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

(致謝：本文全部實驗均在廣西科技大學(xué)科學(xué)實驗中心完成，特此致謝！)

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