石琴華，王涵琪，周 唯，吳小平，牛紅艷，周春花

(南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌 330031)

豬蛔蟲(Ascarissuum)隸屬于線蟲綱、蛔蟲目蛔科，是寄生于豬小腸的大型寄生線蟲，它廣泛流行，呈世界性分布,集約化飼養(yǎng)的豬和散養(yǎng)豬均廣泛感染[1]。豬蛔蟲給養(yǎng)豬業(yè)帶來了很大的危害，一是感染普遍，二是嚴(yán)重影響仔豬生長(zhǎng)發(fā)育[2]。據(jù)調(diào)查報(bào)道，我國(guó)豬群感染豬蛔蟲的感染率為17%～80%，這給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失[1]。豬蛔蟲病對(duì)育肥豬的影響很大，當(dāng)育肥豬感染蛔蟲后，它們的生長(zhǎng)速度會(huì)下降，對(duì)飼料的利用率也會(huì)降低，隨之體重比正常育肥豬低，育肥期延長(zhǎng)，更甚者會(huì)導(dǎo)致豬發(fā)育停滯，甚至死亡[3]。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)不加入成熟核糖體，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快，在核苷酸序列及長(zhǎng)度上存在變異性[4]，因此ITS1被廣泛應(yīng)用于蛔蟲基因型鑒定[5-6]。早期，Zhu X等[6]首次對(duì)不同國(guó)家的人蛔蟲與豬蛔蟲種群的ITS核苷酸序列進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)ITS1基因序列存在6個(gè)核苷酸差異，并用這些差異來區(qū)分人蛔蟲和豬蛔蟲；Peng W D等[5]用SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)鑒定出中國(guó)人蛔蟲ITS1片段有5種基因型(即G1、G2、G3、G4和G5)，中國(guó)豬蛔蟲有3種(G1、G2和G3)，人蛔蟲種群主要以G1為主，而豬蛔蟲主要以G3為主。Leles D等[7]基于ITS1基因分子標(biāo)記對(duì)巴西人蛔蟲的研究中發(fā)現(xiàn)了一種新的基因型(G6)；隨后，他對(duì)來自巴西兩個(gè)不同地區(qū)的人蛔蟲個(gè)體內(nèi)ITS1序列差異進(jìn)行了分析，克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)一個(gè)樣本中存在2～4個(gè)單倍型，且檢測(cè)到了13個(gè)新的單倍型，于是提出ITS1基因?qū)τ谟脕龛b別人蛔蟲的基因型應(yīng)該重新考慮[8]。之后，Das K等[9]對(duì)印度人蛔蟲種群的遺傳模式和遺傳多樣性進(jìn)行了探討，結(jié)果鑒定出試驗(yàn)的大部分人蛔蟲樣本的ITS1序列屬于基因型G1，并發(fā)現(xiàn)了8個(gè)新的ITS1序列。Sparks A M等[10]通過PCR-RFLP方法對(duì)厄瓜多爾和桑給巴爾的蛔蟲的ITS區(qū)域進(jìn)行了分析，在采自桑給巴爾人體內(nèi)的一個(gè)蛔蟲樣本中發(fā)現(xiàn)了豬蛔蟲的ITS基因型，作者解釋這可能是歷史遺留的特征；Jesudoss C J等[11]對(duì)美國(guó)愛爾華地區(qū)豬感染的蛔蟲進(jìn)行了研究，通過PCR-RFLP方法對(duì)ITS的基因型進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些樣本中存在人型和雜交型蛔蟲。對(duì)于人蛔蟲與豬蛔蟲的分類地位一直存在著爭(zhēng)議，不少的研究學(xué)者利用不同的分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行了探討[12-13]，近年來的研究表明新一代的測(cè)序可以提供多個(gè)基因組序列，如旋毛蟲[14]和血吸蟲[15]，類似的方法可以應(yīng)用于世界各地同域地區(qū)隔離的蛔蟲，這為蛔蟲種群的比較基因組研究開辟了新的路徑，從而為蛔蟲的傳播和進(jìn)化提供了前所未有的見解，同時(shí)也對(duì)其是否為一個(gè)種提供了更明確的結(jié)論[13]。本研究的目的是通過分析豬蛔蟲ITS1個(gè)體內(nèi)序列差異，評(píng)估該區(qū)域作為分子標(biāo)記鑒定人蛔蟲和豬蛔蟲差異、基因分型方面的價(jià)值，同時(shí)對(duì)豬蛔蟲的防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 豬蛔蟲采自江西省新建縣的屠宰場(chǎng)的豬體內(nèi)，獲取的成蟲用生理鹽水洗干凈后，置于-80℃冰箱中保存。

1.1.2 主要試劑 蛋白酶K、dNTP、TaKaRa 10×buffer、MgCl2、Taq酶，購(gòu)自南昌天沃科技有限公司；Wizard?SV Genomic DNA Purification System，Promega公司產(chǎn)品；EZ-10 spin column PCR product purification kit，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；PMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取成蟲樣本體壁組織50 mg，將其置于2 mL離心管中剪碎，用蛋白酶K消化過夜，使用Promega公司的試劑盒(Wizard?SV Genomic DNA Purification System)提取基因組DNA。

1.2.2 ITS1擴(kuò)增及分子克隆 采用朱興全[6]等報(bào)道的引物NC5和NC13R擴(kuò)增ITS1。正向引物NC5為5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′，反向引物NC13R為：5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3′，引物是由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為100 μL：12 μL MgCl2，10 μL TaKaRa 10×buffer，10 μL的dNTP(2.5 mmol/L)，1 μLTaq酶，引物各5 μL(10 μmol/L)，模板3.3 μL，加雙蒸水至100 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；接著進(jìn)行30個(gè)循環(huán)：94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s；最后72℃延伸5 min。使用試劑盒(EZ-10 spin column PCR product purification kit)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后進(jìn)行酶連，將目的片段連接到PMD18-T載體上，隨后將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑選單個(gè)白色菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，再PCR擴(kuò)增菌落，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR產(chǎn)物，最后將菌落PCR產(chǎn)物(每個(gè)樣本選取3個(gè)菌液)為陽性的菌液送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.2.3 序列比對(duì) 通過MEGA5.0將獲得的序列與GenBank中下載的序列進(jìn)行比對(duì)，找出豬蛔蟲個(gè)體內(nèi)ITS1序列差異。

2 結(jié)果

擴(kuò)增ITS1基因獲得約500 bp的片段(圖1)，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶連、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)菌落PCR產(chǎn)物(圖2)，獲得15個(gè)克隆子。測(cè)序共得到7個(gè)不同的ITS1基因序列。通過MEGA5.0將經(jīng)過分子克隆的測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列(G1-G6)進(jìn)行對(duì)比，有2個(gè)ITS1基因序列與之前研究過的2種基因型(G2和G3)相同，除此之外還檢測(cè)到5種新的單倍型(命名為HC1-HC5)(表1)。在所測(cè)樣本中，有2個(gè)樣本(ZC2和ZC5)檢測(cè)到3種基因型或單倍型，有1個(gè)樣本(ZC1)檢測(cè)到2種基因型或單倍型，沒有樣本檢測(cè)到G1、G4、G5、G6基因型(表2)，G3基因型存在大多數(shù)的樣本中。檢測(cè)到的新的單倍型和GenBank中已有的基因型或單倍型部分多態(tài)位點(diǎn)見表2。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000；1～5.樣本；6.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 1 000; 1-5.Samples; 6.Negative control

圖1 ITS1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ITS1 gene PCR products

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～9.菌落PCR產(chǎn)物；10.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-9.Colony PCR products; 10.Negative control

圖2 菌落PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 中國(guó)與全球各地蛔蟲ITS1的基因型/單倍型的部分多態(tài)性位點(diǎn)

注：H.人；P.豬；Al：A.lumbricoides,As.A.suum；Ba.孟加拉國(guó)；Br.巴西；Ch.中國(guó)；Au.澳大利亞；UK.英國(guó)；De.丹麥；S.核苷酸G或C；-.核苷酸缺失；· .與G1型相同；▼在這篇論文中。

Note:H.human;P.pig;Al:A.lumbricoides(without nomenclature),As.A.suum(without nomenclature);Ba.Bangladesh;Br.Brazil;Ch.China;Au.Australia;UK.United Kingdom;De.Denmark;S.Nucleotide G or C;-.nucleotide deletion,dots:similar to reference sequence G1;▼.In this paper.

3 討論

由于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)屬于非編碼區(qū)且有多個(gè)拷貝(在蛔蟲中有42個(gè)拷貝[16])，所以在單個(gè)蛔蟲個(gè)體內(nèi)ITS1序列可能存在差異。本研究檢測(cè)到了這種差異，即同一豬蛔蟲樣本的ITS1序列中存在多種基因型或單倍型。Peng W D等[5]檢測(cè)到的G2、G4和G5基因型包含可變位點(diǎn)，認(rèn)為這些可變位點(diǎn)是由不同基因型蛔蟲個(gè)體之間雜交造成的。而我們認(rèn)為這實(shí)際上是兩種不同的ITS基因型特征在同一個(gè)體內(nèi)的表現(xiàn)。從表2中可以看到，同一個(gè)體的ITS1序列拷貝并不完全一致，總是會(huì)有個(gè)別的堿基差異，在polyA和polyT之間尤為明顯，造成這種現(xiàn)象的原因，除了測(cè)序的因素以外，我們認(rèn)為還有一個(gè)很重要的因素，即ITS1個(gè)體內(nèi)差異。由以前的文獻(xiàn)得知，即使是同一個(gè)體也可能含有多種ITS1序列[17]，僅僅是數(shù)量不同而已，堿基A和堿基T之間只有2個(gè)氫鍵相連，所以更加容易發(fā)生變異。這也與Leles D等[8]得到的結(jié)論相符?？傊?，將ITS1序列作為鑒別豬蛔蟲基因型的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該重新加以考慮。

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