水稻根系生長素抗性突變體的篩選及表型鑒定

張志昌，潘偉槐，嚴(yán)旭，尹守鵬，程祝寬，潘建偉5*

（1.浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華321004；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州銅仁554300；3.紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江紹興312000；4.中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所，北京100101；5.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730000）

植物根系是植物體吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，同時還具有固定地上部分、分解有毒物質(zhì)和感知環(huán)境刺激或脅迫等生物學(xué)功能。水稻（Oryza sativa L.）是重要的單子葉模式作物，其根系主要是由初生根、不定根及其側(cè)根組成的須根系，生長發(fā)育調(diào)控比雙子葉模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的直根系復(fù)雜得多[1]。水稻生長發(fā)育受內(nèi)源激素調(diào)控，主要包括生長素代謝（合成、降解）途徑、生長素運輸途徑、生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其他激素調(diào)控[2]。生長素合成途徑中的限速基因YUCCA1的超表達(dá)可以引起吲哚乙酸水平提高，促進水稻不定根的形成[3]。OsPIN1基因?qū)儆谏L素極性運輸?shù)鞍譖IN家族，其沉默后會抑制不定根的發(fā)育[4]。OsRAA1（Oryza sativa root architecture associated 1）能夠通過泛素蛋白酶途徑進行降解，OsRAA1的超表達(dá)會抑制主根生長和使不定根數(shù)目增加[5]；水稻Aux/IAA基因家族OsIAA11（indole-3-acetic acids 11）基因突變能夠抑制水稻側(cè)根原基的形成[6]。

植物根系生長于土層中，其生長發(fā)育表型分析遠(yuǎn)比地上部分困難，因此在水稻中鮮有與生長素相關(guān)突變體的報道，而現(xiàn)有成果主要是通過擬南芥研究取得。本研究擬通過人工合成的生長素類似物2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D）處理，從輻射誘變的水稻突變體庫中篩選水稻根系生長素抗性突變體，并分析突變體的主根、不定根和側(cè)根形成與生長對2，4-D處理的響應(yīng)，鑒定其表型，以期為后續(xù)目的基因的克隆和功能鑒定奠定理論基礎(chǔ)，以及為揭示水稻根系生長發(fā)育調(diào)控機制提供遺傳學(xué)研究材料；同時，水稻作為重要的糧食作物，發(fā)育良好的根系是農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要保障，因此，深入展開水稻根系發(fā)育調(diào)控研究具有重要的實踐指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

為建水稻突變體庫，于2012年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能研究所，利用60Co-γ（誘變劑量400 Gy）輻射誘變野生型黃華占（Oryza sativa L.ssp.indica）水稻種子。經(jīng)繁殖，在M2代共獲得3 805個獨立株系。

1.2 水稻初生根伸長對外源2，4-D處理的響應(yīng)測定

參照PAN等[7]的方法，并略作改進。經(jīng)ddH2O浸泡后的野生型黃華占種子4℃低溫處理5 d后，于37℃條件下萌發(fā)24 h，播種于96孔板上，在0.1 mmol/LCaC12水溶液中，光照培養(yǎng)72 h（光照16 h/黑暗8 h，光強3×104lx，溫度32℃/28℃，濕度75%）。將萌發(fā)4 d后的水稻幼苗進行生長素類似物2，4-D濃度梯度試驗。選取長勢一致的幼苗，每個處理組10株。2，4-D濃度梯度（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和5.0 μmol/L）用0.1 mmol/L CaCl2水溶液進行配制，分別處理水稻幼苗72 h。處理前后分別測量水稻初生根根長（root length,RL），以分析不同生長素濃度對水稻初生根伸長的抑制作用。生長素對初生根伸長的抑制率計算公式為：抑制率=1-（RL2,4-D-72h-RLCK-0h）/（RLCK-72h-RLCK-0h）。本試驗至少獨立重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，用t-檢驗（Student’s t-test）進行顯著性分析。

1.3 水稻突變體生長素抗性表型的初篩方法

本研究所用水稻突變體庫共有3 805個獨立株系，每個株系取25～30粒種子，經(jīng)ddH2O浸泡后，4℃低溫處理5 d，再于37℃條件下萌發(fā)24 h，播于96孔板中，在 0.5 μmol/L 2，4-D 水溶液（含有0.1 mmol/L CaCl2）中，光照培養(yǎng) 72 h（光照16 h/黑暗8 h，光強3×104lx，溫度32 ℃/28 ℃，濕度75%）。以野生型黃華占為對照，測量每個株系初生根在2，4-D處理前后的根長。每個處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，用t-檢驗進行顯著性分析。在本研究中，將初生根伸長長度為野生型2倍或2倍以上的突變體株系初步定為候選生長素抗性突變體。

1.4 候選突變體的生長素抗性表型的鑒定

對經(jīng)初篩后的候選突變體對生長素抗性表型進行二次鑒定，以確定是否為真正的生長素抗性突變體。從每個候選突變體株系中選取100粒飽滿籽粒，經(jīng)ddH2O浸泡后4℃低溫處理5 d，再置于37℃條件下萌發(fā)24 h，播于96孔板中，2，4-D濃度梯度為 0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 和 5.0 μmol/L（含有0.1 mmol/LCaCl2），光照培養(yǎng)72 h（光照16 h/黑暗8 h，光強3×104lx，溫度32℃/28℃，濕度75%）。處理前后分別測量水稻初生根根長，以分析不同生長素濃度對水稻初生根伸長的抑制作用。每個處理重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，用t-檢驗進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻生長素抗性突變體篩選體系的建立

在對水稻突變體庫進行生長素抗性突變體篩選之前，需要確定生長素最佳篩選濃度。本研究利用人工合成生長素類似物2，4-D不同濃度梯度對野生型水稻黃華占初生根伸長的影響進行了分析，結(jié)果如圖1A所示。與空白對照相比，0.01 μmol/L 2，4-D明顯促進了根的伸長，表明低濃度生長素能夠促進水稻初生根的伸長。然而，從圖1B可以看出，0.05、0.1、0.5、1.0和5.0 μmol/L的2，4-D均抑制了幼苗初生根的伸長，其抑制率分別為15%、33%、85%、94%和99%。這說明隨著2，4-D濃度的增加，生長素對初生根伸長的影響表現(xiàn)為抑制作用。因此，為篩選高抗生長素突變體，本研究將抑制率為85%、濃度為0.5 μmol/L的2，4-D（P＜0.001）作為篩選生長素抗性突變體的初篩濃度。

圖1 不同濃度外源2，4-D處理對水稻初生根伸長的影響Fig.1 Effects of exogenous 2,4-D treatment with different concentrations on primary root elongation in rice

2.2 水稻生長素抗性突變體的初篩和二次鑒定

本研究利用0.5 μmol/L的2，4-D篩選濃度，對水稻突變體庫中的3 805個突變體株系進行了初篩，共獲得188個候選突變體株系，為二次篩選奠定了基礎(chǔ)。

為驗證這188個候選突變體株系是否為真正的高抗生長素突變體，利用2，4-D不同濃度梯度對其進行二次鑒定。結(jié)果表明，在188個株系中，僅4個株系真正表現(xiàn)為根系生長素高抗表型，分別被命名為Osarr1-1（Oryza sativa auxin resistant root 1-1）、Osarr2-1、Osarr3-1和Osarr3-2突變體。在0.01、0.1、0.5和 1.0 μmol/L 2，4-D 處理 72 h后，突變體Osarr1-1初生根伸長量高于野生型對照組（圖2A和E），表明Osarr1-1初生根伸長對生長素具有較強抗性。突變體株系Osarr2-1在0.1和0.5 μmol/L 2，4-D處理組中，其初生根伸長對2，4-D處理表現(xiàn)出較強的生長素抗性（圖2B和F）。突變體株系Osarr3-1初生根伸長對 0.01、0.05、0.1、0.5和 1.0 μmol/L 2，4-D處理均表現(xiàn)出極強的生長素抗性（圖2C和G）。此外，由圖2A～D可知，在無2，4-D處理的情況下，Osarr1-1、Osarr2-1和Osarr3-1突變體與野生型的初生根伸長完全相似（P＞0.05）。

圖2 水稻生長素抗性突變體的表型鑒定Fig.2 Phenotypic identification of auxin-resistant mutants in rice

2.3 外源2，4-D處理對Osarr1-1和Osarr2-1突變體根系的影響

為進一步分析2，4-D對突變體不定根和側(cè)根的影響，本研究測定了經(jīng)生長素處理后野生型和突變體不定根和側(cè)根的數(shù)目和伸長。由圖3I可知：在無2，4-D存在的情況下，Osarr1-1和Osarr2-1的不定根數(shù)目與野生型相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Osarr1-1不定根伸長小于野生型，而Osarr2-1不定根伸長與野生型相似；在0.5 μmol/L 2，4-D處理下，Osarr1-1和Osarr2-1的不定根數(shù)目明顯多于野生型。從圖3A～D中可知：盡管2，4-D處理沒有明顯影響野生型不定根的形成和數(shù)目，但明顯抑制了其伸長；相反，與野生型相比，2，4-D處理對Osarr1-1和Osarr2-1不定根伸長的影響相對較小，表明Osarr1-1和Osarr2-1不定根伸長對2，4-D處理不敏感。

此外，本研究還分析了2，4-D處理對側(cè)根的影響。結(jié)果（圖4A和B）表明：在無2，4-D的情況下，Osarr1-1的側(cè)根長度明顯比野生型短，但其側(cè)根數(shù)目無明顯差異（P＞0.05）；而Osarr2-1的側(cè)根數(shù)目和長度與野生型相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在0.5 μmol/L2，4-D處理后，Osarr1-1和Osarr2-1側(cè)根長度和數(shù)目均明顯高于野生型。這表明，Osarr1-1和Osarr2-1突變體根系包括初生根、不定根和側(cè)根的形成與伸長對2，4-D處理表現(xiàn)為不敏感。

2.4 外源2，4-D處理對Osarr3突變體根系的影響

在對Osarr3突變體株系進行鑒定的過程中，發(fā)現(xiàn)有綠苗（Osarr3-1）與白化苗（Osarr3-2）分離，并且呈3∶1（35∶11≈3.18∶1）的分離比例，暗示白化苗性狀由單基因突變引起。因此，我們將這些分離出來的白化苗突變體命名為Osarr3-2。由于該白化苗突變體在三葉期時的葉色可以由白轉(zhuǎn)綠并繼續(xù)存活繁殖，最終能獲得種子，因此，本研究對Osarr3-1和Osarr3-2突變體不定根和側(cè)根的形成與伸長同時進行了分析。

由圖3I可知：在無2，4-D的情況下，與野生型相比，Osarr3-1不定根數(shù)目明顯增加，但Osarr3-2則無明顯差異（P＞0.05）；在0.5 μmol/L 2，4-D處理下，Osarr3-1和Osarr3-2不定根數(shù)目明顯高于野生型。與Osarr1-1和Osarr2-1相似，Osarr3-1和Osarr3-2不定根伸長也表現(xiàn)為對2，4-D處理不敏感（圖3F和H）。對Osarr3-1和Osarr3-2側(cè)根的分析結(jié)果（圖4）表明：在無2，4-D的情況下，Osarr3-1側(cè)根數(shù)目和伸長與野生型相比沒有差異（圖4A，B和G；P＞0.05），而Osarr3-2側(cè)根形成和伸長明顯受抑制（圖4A，B和I）。在0.5 μmol/L 2，4-D處理組中，Osarr3-1側(cè)根形成與伸長均高于野生型，表現(xiàn)出對2，4-D處理不敏感（圖4A，B和H）；而Osarr3-2側(cè)根形成對2，4-D處理的敏感性與野生型相似（圖4B和J；P＞0.05），但其側(cè)根伸長明顯高于野生型（圖4A和J）。Osarr3-1和Osarr3-2突變體在不同發(fā)育時期的表型見圖5。

3 討論

由于不同水稻品種對2，4-D的敏感性差異較大，因此，在篩選水稻突變體庫之前，本研究首先測定了野生型水稻品種黃華占對2，4-D的敏感性。然后，對由60Co-γ輻射誘變的水稻突變體庫進行生長素抗性初篩，共篩選到188個候選抗性株系。經(jīng)生長素抗性二次鑒定后，最終獲得4個生長素抗性穩(wěn)定的突變株系。這一結(jié)果暗示，利用單一生長素濃度的初篩，其假陽性結(jié)果非常高；因此，二次鑒定十分必要。

圖3 外源2，4-D處理對水稻不定根的影響Fig.3 Effects of exogenous 2,4-D treatment on adventitious roots of rice

圖4 外源2，4-D處理對水稻側(cè)根的影響Fig.4 Effects of exogenous 2,4-D treatment on lateral roots of rice

圖5 Osarr3-1和Osarr3-2在不同發(fā)育時期的表型Fig.5 Phenotypes of Osarr3-1 and Osarr3-2 at different developmental stages

已知生長素調(diào)控植物向性生長、逆境脅迫響應(yīng)和側(cè)生器官的形成等均是通過生長素信號途徑調(diào)控下游有關(guān)基因的表達(dá)來實現(xiàn)的[8-9]。擬南芥生長素受體TIR1/AFB或生長素響應(yīng)因子ARF的功能缺陷都會引起植株對外源生長素敏感性的改變[10-11]。在水稻中，目前已經(jīng)報道的水稻生長素信號傳導(dǎo)突變體大多與水稻不定根和側(cè)根形成相關(guān)。如超表達(dá)OsRAA1基因能夠抑制水稻初生根的伸長，但同時促進不定根的形成，其植株對外源生長素處理超敏感，以及向性生長遲緩等[5，12]。對水稻根系的遺傳學(xué)分析表明，水稻生長素相關(guān)突變體如crl1/arl1表現(xiàn)出不定根的缺陷，OsCRL1/ARL1表達(dá)受生長素響應(yīng)因子OsARF的調(diào)控，表明生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在水稻不定根形成調(diào)控中具有關(guān)鍵性作用[13-14]。同樣，OsIAA1和OsIAA11功能缺陷抑制了側(cè)根的形成和生長，表明OsIAA1和OsIAA11參與調(diào)控水稻側(cè)根的形成與發(fā)育[6，15]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，OsIAA11通過與OsIPK2互作調(diào)控側(cè)根的形成，OsIPK2的超表達(dá)促進了OsIAA11蛋白的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致其在植株內(nèi)的積累[16]。

本研究通過2，4-D處理篩選獲得4個高抗生長素水稻突變體株系Osarr1-1、Osarr2-1、Osarr3-1和Osarr3-2。這些突變體根系（主根、側(cè)根和不定根）的形成與生長對2，4-D處理均表現(xiàn)為不敏感，與已報道的擬南芥和水稻抗生長素突變體的表型相似。但在無2，4-D情況下，這4個突變體的不定根和側(cè)根表型不完全相似；因此，這4個突變體很可能與生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的不同組分有關(guān)。當(dāng)然，也不能完全排除與生長素生物合成途徑相關(guān)[17]，因為2，4-D處理對這4個突變體的不定根形成和生長有一定程度的促進作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Osarr3-2白化苗突變體的白化苗表型在三葉期后自動消失，推測其突變位點很可能推遲了葉綠體的發(fā)育。然而，要進一步揭示其內(nèi)在調(diào)控機制，必須首先分離克隆這些突變基因。因此，今后的研究工作重點是利用圖位克隆技術(shù)分離克隆這些目標(biāo)基因，為解析水稻根系形成與生長調(diào)控機制提供新的觀點。

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