王 鳴 劉君慧 習(xí) 東 寧 琴

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院感染免疫研究所 (湖北 武漢， 430030)

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤患者的致死率中高居第三位[1]。我國(guó)是HCC高發(fā)國(guó)家，發(fā)病率占世界范圍的55%[2]。近年來腫瘤的基因治療逐漸受到重視，探索并設(shè)計(jì)針對(duì)性的靶向干預(yù)藥物，對(duì)新型腫瘤生物治療的開發(fā)具有重要意義。我們研究發(fā)現(xiàn)fgl2凝血酶原酶(fgl2)在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，瘤內(nèi)注射針對(duì)人fgl2的微小RNA(hfgl2-miRNA)可顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤血管新生[3]。我們前期成功構(gòu)建了腺病毒介導(dǎo)的重組人hfgl2-miRNA(Ad-hfgl2-miRNA)，體內(nèi)外研究均證實(shí)對(duì)靶基因hfgl2具有顯著抑制作用。目前，有關(guān)Ad-hfgl2-miRNA的生物分布及安全性問題尚很少涉及，因此，我們采用瘤內(nèi)注射Ad-hfgl2-miRNA，觀察其在裸鼠瘤內(nèi)及非靶器官中的生物學(xué)分布，探討Ad-hfgl2-miRNA的體內(nèi)安全性，為Ad-hfgl2-miRNA的進(jìn)一步臨床研究做好鋪墊。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雄性BALB/c-nu裸鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重20～22g，飼養(yǎng)于本研究所IVC(智能型獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具)，恒溫恒濕條件下供應(yīng)滅菌墊料、飼料、飲水。飼養(yǎng)1周左右開始實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)過程均需在無菌條件下執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)前將裸鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(Ad-hfgl2-miRNA)、陰性對(duì)照組(Ad-irrelevant-miRNA)，每組6只裸鼠，還有6只健康祼鼠作為空白對(duì)照組。

1.2 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；SYBGREEN Mix購(gòu)自日本TOYOBO公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司。

1.3 病毒、引物及細(xì)胞 腺病毒Ad-hfgl2-miRNA由本研究所前期構(gòu)建和保存，使用TCID50法測(cè)定Ad-hfgl2-miRNA的滴度，按109IU/只的病毒量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；人高侵襲性肝癌細(xì)胞系HCCLM6購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所。

1.4 裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型建立 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCCLM6細(xì)胞，按1×106個(gè)/ml重懸細(xì)胞，選取祼鼠背部皮膚褶皺較多部位為注射點(diǎn)，按200μl/只接種細(xì)胞。術(shù)后每日觀察祼鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量并計(jì)算腫瘤體積(公式為1/2×最長(zhǎng)直徑×最短直徑2)，待皮下移植瘤體積>100mm3時(shí)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 給藥與取樣 按設(shè)定劑量，實(shí)驗(yàn)組每只裸鼠注射Ad-hfgl2-miRNA 1×109IU，陰性對(duì)照組每只注射Ad-irrelevant-miRNA 1×109IU，瘤內(nèi)多點(diǎn)注射。于給藥后第1、3、7、9、11、15、19、24天取裸鼠眼球血，并分別取出皮下移植瘤及心、肝、脾、肺、腎、小腸，液氮速凍，并保存于-80℃冰箱。空白對(duì)照組裸鼠僅末次取樣。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分別取50mg腫瘤及各臟器組織，加入1ml Trizol(4℃預(yù)冷)，按說明書方法提取總RNA，檢測(cè)Ad-hfgl2-miRNA水平，引物序列為：上游引物5’-ACCAGCACAGTGTATCCG-3’，下游引物5’-CCAAGTTCTTCCACGCATT-3’，以GAPDH作為內(nèi)參。反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性30s，95°C變性5s, 58°C退火5s，72°C延伸15s，40個(gè)循環(huán)。

1.7 生化指標(biāo)檢測(cè) 取第1、3、7、11、24天裸鼠眼球血，離心取血清后送同濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，分別檢測(cè)谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶L (LDH-L)等指標(biāo)。

1.8 組織病理學(xué)檢測(cè) 注射Ad-hfgl2-miRNA 1×109IU后第1、3、7、11、24天取裸鼠心、肝組織，置4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，行HE染色，鏡下觀察病理學(xué)改變。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件分析熒光定量PCR數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ad-hfgl2-miRNA在裸鼠人肝癌模型的體內(nèi)分布及表達(dá)情況 見表1。hfgl2-miRNA在裸鼠心、肝、脾、肺、腎、瘤、小腸中均有表達(dá)，以心、肝、腎、荷瘤、小腸表達(dá)較強(qiáng)，可維持至給藥后第24天。其中，第3天肝臟hfgl2-miRNA水平為表達(dá)高峰，較陰性對(duì)照組明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第3天與第7天的心、腎hfgl2-miRNA，表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯增高，兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在第7天。瘤組織、小腸hfgl2-miRNA水平，第7天為表達(dá)高峰，較陰性對(duì)照組明顯增高，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 3組小鼠生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 見表2。注射Ad-hfgl2-miRNA后，各時(shí)間點(diǎn)的ALT、AST、CK、LDH-L、BUN、Cr均未見明顯異?；騼H有輕度異常，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩組裸鼠不同時(shí)間段Ad-hfgl2-miRNA在各臟器的表達(dá)量比較

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05

表2 3組祼鼠生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較

2.3 實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝臟和心臟組織病理學(xué)變化 顯微鏡下可見肝臟和心臟組織輕微炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見明顯實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷性改變(如：細(xì)胞大量壞死，明顯出血等)，見插頁圖1。

3 討論

作為一種新的凝血酶原酶分子，fgl2凝血酶原酶可直接促進(jìn)凝血酶的生成而不依賴于其他凝血因子，凝血酶可通過降解纖維蛋白原形成纖維蛋白導(dǎo)致血栓形成和纖維素的沉積[4]。fgl2與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)：常見實(shí)體腫瘤如肝癌、食管癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的實(shí)質(zhì)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)均有fgl2凝血酶原酶的廣泛表達(dá)，并與纖維蛋白沉積有密切組織學(xué)關(guān)系[5]。作為凝血酶的上游基因，我們推測(cè)fgl2在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及血管新生中亦發(fā)揮了重要作用。我們應(yīng)用裸鼠角膜血管新生模型和腫瘤皮下瘤移植模型顯示fgl2基因沉寂后的人肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生的能力顯著降低；fgl2敲除的高侵襲性人肝癌細(xì)胞HCCLM6細(xì)胞增殖能力、侵襲能力，耐受TNFα誘導(dǎo)的凋亡能力、表達(dá)促血管生成因子如IL-8、VEGF的能力較未干擾HCCLM6細(xì)胞及非相關(guān)對(duì)照HCCLM6細(xì)胞均顯著下降，表明fgl2在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)在腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[6]。

基因治療是將具有治療價(jià)值的基因通過載體導(dǎo)入人體細(xì)胞中，直接進(jìn)行表達(dá)，抑制、替代或補(bǔ)償缺陷基因，以達(dá)到防治或減輕疾病的目的。腺病毒載體是基因治療中最常用到的病毒載體，具有病毒滴度高、不整合到宿主基因組中、能夠感染分裂相和非分裂相細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)點(diǎn)使得腺病毒載體成為最適合用于癌癥基因治療的載體。我們運(yùn)用Ad-hfgl2-miRNA觀察其對(duì)裸鼠人肝癌皮下移植瘤的治療效果，結(jié)果顯示其可通過下調(diào)fgl2基因的表達(dá)而顯著抑制皮下移植瘤生長(zhǎng)，同時(shí)也觀察到實(shí)驗(yàn)組裸鼠腫瘤組織內(nèi)新生血管數(shù)目減少[7]。目前，部分基于腺病毒載體的肝癌治療方案已進(jìn)入臨床I 期或II期研究[8]，有望在現(xiàn)有治療水平的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高肝癌患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間，為今后肝癌等惡性腫瘤的治療提供新思路。

作為臨床前研究的重要部分，研究藥物的生物分布及安全性對(duì)于觀察藥物是否能夠擴(kuò)散到非靶器官，從而尋找毒性靶器官具有重要參考價(jià)值[9]。近年來，基因治療載體在體內(nèi)的分布越來越受到重視。其中，對(duì)腺病毒載體的研究最為廣泛和深入。目前，最常用的檢測(cè)生物分布的方法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR，其具有較高的靈敏性和特異性，不需要進(jìn)行PCR 后續(xù)操作[10]。研究表明，給藥方式的不同其生物分布亦有差別。Huang D[11]等通過不同給藥途徑注射靶向CD40 的腺病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過靜脈給藥后腺病毒主要分布在肺部和淋巴結(jié)，通過皮內(nèi)注射后腺病毒主要分布在引流淋巴結(jié)和皮膚，而通過鼻內(nèi)給藥后腺病毒在肝臟和脾臟中均未檢測(cè)到。胡衛(wèi)[10]等通過瘤內(nèi)注射重組腺病毒TOA02，發(fā)現(xiàn)腺病毒主要分布在瘤內(nèi)、肝、腎、脾、肺、心臟，以瘤內(nèi)最多。本研究同樣使用瘤內(nèi)注射的方式，結(jié)果顯示腺病毒在心、肝、脾、肺、腎、瘤、小腸中均有表達(dá)，以心、肝、腎、荷瘤、小腸表達(dá)較強(qiáng)，與上述瘤內(nèi)注射重組腺病毒TOA02的結(jié)果略有不同。腺病毒之所以分布于心、肝、腎、瘤等血供豐富的部位，可能是由于腺病毒主要與柯薩奇B病毒共用一種受體，即柯薩奇/腺病毒受體(CAR)[12]。CAR 分布廣泛， mCAR 分布于心、肝、腎、肺等組織，且在肝臟中表達(dá)量最高。這種組織內(nèi)的廣泛分布通常是短暫的，待病毒含量下降后，各組織的病毒也會(huì)隨之被清除。腺病毒載體的這一特點(diǎn)對(duì)某些僅需要外源基因短暫表達(dá)的基因治療是有利的,基因的持續(xù)表達(dá)可能會(huì)引起機(jī)體功能紊亂和毒副作用的出現(xiàn)。

盡管基因治療目前還處于起步階段，在目的基因有效性及作用持久性、載體的靶向性和基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的可控性等方面存在一系列有待解決的問題，但可以預(yù)見，只要堅(jiān)持嚴(yán)格的科學(xué)態(tài)度,設(shè)計(jì)精細(xì)的臨床研究，基因治療離人們將越來越近。

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