正常和早熟雄性河蟹副性腺蛋白和血淋巴中17β-雌二醇及睪酮濃度的比較

潘穎

（聊城市科學(xué)技術(shù)情報(bào)研究所，山東 聊城 252000）

中華絨螯蟹Eriocheir sinensis（俗稱河蟹）肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，進(jìn)行了較多的研究，如雌性河蟹卵黃物質(zhì)積累及其轉(zhuǎn)運(yùn)、卵巢的發(fā)育及其中相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)的組成等。而對雄性河蟹的研究則主要是生殖系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和組織化學(xué)、精莢的形成和精子的發(fā)生以及雄性生殖的營養(yǎng)和代謝等[5-8]。

對河蟹血淋巴的研究較多，主要是20-羥基蛻皮酮、17β-雌二醇和睪酮含量的變動[13]和蛻皮過程中血淋巴主要生化成分的變化等[14]。但目前關(guān)于河蟹副性腺的研究很少，多數(shù)集中在消化精莢及與精子頂體反應(yīng)等與精子有關(guān)的研究，以及副性腺的組織結(jié)構(gòu)，但是對其具體結(jié)構(gòu)和功能尚沒有較為系統(tǒng)的報(bào)道。

河蟹性早熟嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，對河蟹性早熟機(jī)制的研究有很多，但機(jī)理還不清楚。通常認(rèn)為河蟹性早熟是內(nèi)因（遺傳特性）和外因（鹽度[16]、溫度、水深、水質(zhì)、水草、營養(yǎng)過剩、放養(yǎng)密度、飼料搭配和人為管理等）[17]共同作用的結(jié)果，還有一些激素分泌的變化。

本研究通過提取正常和早熟河蟹副性腺蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，測定血淋巴中17β-雌二醇和睪酮的含量，以探究正常和早熟河蟹副性腺蛋白和兩種激素含量的差異和早熟的機(jī)理，為進(jìn)一步探究河蟹性早熟機(jī)理、預(yù)防河蟹性早熟及提高河蟹產(chǎn)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

正常和早熟雄性河蟹購自河北省唐山市曹妃甸區(qū)，按李晨虹等的方法[26]，分別挑選性早熟河蟹（體質(zhì)量 20～30g） 和正常成熟河蟹（體質(zhì)量95～130g），在水族箱（100cm×40cm×50cm）中暫養(yǎng)，水位10cm左右，循環(huán)水，飼養(yǎng)特制玉米（非轉(zhuǎn)基因）。

無鈣離子人工海水（Ca2+-FASW）配制：稱取NaCl 13.8795g，KCl 0.4473g，MgCl21.425g，Tris堿 1.2114g，加無離子水定容至500mL，pH調(diào)至8.2。

凝膠貯液（30%聚丙烯酰胺貯液）配制：稱取丙烯酰胺150g，甲叉雙丙烯酰胺4g，加無離子水定容至500mL，濾紙過濾后即可使用。

pH8.8 Tris-HCl緩沖液：稱取 Tris堿 90.75g，加無離子水定容至500mL，pH調(diào)至8.8。

pH6.8 Tris-HCl緩沖液：稱取Tris堿12g，加無離子水定容至200mL，pH調(diào)至6.8。

10%SDS：稱取SDS 1g，加無離子水定容至10mL，混勻。

10%AP：稱取AP 1g，加無離子水定容至10mL，混勻。

2×SDS-PAGE上樣緩沖液：量取0.5MpH6.8 Tris堿 2.0mL，10%SDS4.0mL，甘油 2.0mL，1%溴酚藍(lán)0.05mL，加無離子水定容至10mL，用時(shí)現(xiàn)加巰基乙醇，每1mL上樣緩沖液加20μL巰基乙醇。

10×電泳緩沖液：稱取Tris堿30g，甘氨酸144g，SDS10g，無離子水 1L，混勻。

脫色液：量取甲醇400mL，冰乙酸100mL，無離子水500mL，混勻。

染色液：稱取2g考馬斯亮藍(lán)R-250，溶于400mL甲醇、100mL冰乙酸、500mL無離子水中，濾紙過濾后即可使用。

1.2 方法

1.2.1 河蟹副性腺蛋白的提取

隨機(jī)挑取正常和早熟雄性河蟹各4只，解剖取出副性腺，用預(yù)冷的無鈣離子人工海水沖洗兩次后，冰浴勻漿，4℃1 000r/min離心5min，棄沉淀，取上清再4℃10 000r/min離心10min，取上清分裝于小管中。每只河蟹的副性腺蛋白分別標(biāo)記為正常1、正常 2、正常 3、正常 4、早熟 1、早熟 2、早熟 3及早熟4，-80℃冰箱保存。

1.2.2 河蟹副性腺蛋白濃度測定

用考馬斯亮藍(lán)法[26]測定獲得的水溶性蛋白質(zhì)的濃度：

取8支離心管，分別加入4只早熟和4只正常河蟹的副性腺蛋白10μL，再分別加入90μL無離子水，再加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑1.0mL，立即在旋渦振蕩器上混勻，加完試劑2～3min后，按順序?qū)?00μL樣品加到96孔板的樣品孔中，用預(yù)熱的酶標(biāo)儀測定A595，再根據(jù)測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算未知樣品的蛋白質(zhì)含量和蛋白濃度，計(jì)算SDS-PAGE凝膠電泳中的合適上樣量。

1.2.3 河蟹副性腺蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳

按表1所示配制12%的分離膠和3.6%的濃縮膠。

用0.02%考馬斯亮藍(lán)R-250染液搖床染色過夜，含有10%冰乙酸的脫色液搖床脫色，直到凝膠上的條帶清晰可見。將凝膠放入掃描儀中，用QuantityOne軟件進(jìn)行圖像掃描。

表1 分離膠和濃縮膠的配制Tab.1 The preparation of the separation and enrichment adhesives

1.2.4 河蟹血淋巴激素濃度測定

隨機(jī)取3只正常和6只早熟的河蟹，由河蟹第三步足的最后一個(gè)關(guān)節(jié)收集血淋巴[14]，4℃過夜，20000r/min4℃離心10min，棄沉淀，上清1000r/min離心2min，再取上清，分裝，-20℃冰箱保存。每只正常河蟹的血淋巴為一組樣本，每2只早熟河蟹的血淋巴為一組樣本。

將500μL血淋巴樣品送至保定市婦幼保健醫(yī)院，測定17β-雌二醇和睪酮濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 河蟹副性腺蛋白濃度

由圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到公式：

y=0.0133x+0.2523，將計(jì)算得到的蛋白含量（μg）除以 10即可得副性腺蛋白濃度（μg/μL）。正常和早熟河蟹副性腺中蛋白濃度見表2。

圖1 河蟹副性腺中蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 A standard curve of concentrations of protein in sexual accessory gland in Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

2.2 河蟹副性腺蛋白SDS-PAGE凝膠電泳

根據(jù)測得的蛋白濃度，取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離，根據(jù)蛋白濃度，以及能在凝膠上得到清晰條帶的蛋白量，選取蛋白量為9.78μg。由于是將蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混合，因而上樣量 =9.78μg/蛋白濃度（μg/μL）×2。

圖2 正常和早熟河蟹副性腺蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE gel electrophoresis of sexual accessory gland in normal and precocious Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

由圖2可知，正常和早熟雄性河蟹副性腺中蛋白的條帶存在差異，除去實(shí)驗(yàn)中的誤差和個(gè)體間的差異，蛋白條帶數(shù)及其分布無明顯差異。但是，早熟雄性河蟹副性腺66.4～97.2kDa的蛋白條帶顏色明顯淺于正常雄性河蟹，表明早熟雄性河蟹副性腺中66.4～97.2kDa蛋白的表達(dá)量低于正常雄性河蟹副性腺。

用QuantityOne軟件對得到的凝膠電泳圖譜進(jìn)行灰度分析（圖3）。

如圖3所示，早熟雄性河蟹副性腺蛋白的灰度值明顯低于正常雄性河蟹副性腺蛋白的灰度值，主要是SDS-PAGE凝膠圖譜中分子量在66.4～97.2kDa間的蛋白條帶。這說明在早熟雄性河蟹副性腺中66.4～97.2kDa間的蛋白表達(dá)量低于正常雄性河蟹。

2.3 河蟹血淋巴激素的濃度

由表4和表5可知，正常雄性河蟹血淋巴中睪酮和17β-雌二醇的濃度顯著高于早熟雄性河蟹。t檢驗(yàn)表明，正常和早熟雄性河蟹血淋巴中睪酮和17β-雌二醇濃度差異非常顯著（P＜0.001）。姜仁良等[13]曾研究不同蛻皮周期的河蟹血淋巴中睪酮和17β-雌二醇的含量，發(fā)現(xiàn)雄性河蟹的血淋巴中睪酮含量在成熟前的蛻皮期不斷上升，在精巢成熟前一個(gè)月達(dá)到峰值，因而睪酮具有誘導(dǎo)精巢發(fā)育的作用。在成熟后7月、8月、9月也出現(xiàn)峰值，說明睪酮具有提高新陳代謝的強(qiáng)度、促進(jìn)生長的作用。

表2 正常和早熟河蟹副性腺蛋白濃度Tab.2 The protein concentrations in sexual accessory gland in normal and precocious Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

圖3 正常和早熟河蟹副性腺蛋白SDS-PAGE灰度分析掃描對比圖Fig.3 SDS-PAGE gray scanning contrast of sexual accessory gland in normal and precocious Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

表4 正常和早熟雄性河蟹血淋巴中睪酮濃度Tab.4 The testosterone concentrations in the hemolymph of normal and precocious male Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

表5 正常和早熟雄性河蟹血淋巴中17β-雌二醇濃度Tab.5 17 beta estradiol levels in the hemolymph of normal and precocious male Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis

3 討論

副性腺蛋白常用于消化精莢[8,10]，表明在副性腺蛋白中存在一些蛋白可導(dǎo)致精莢壁破裂。SDS-PAGE凝膠電泳分析顯示：不同時(shí)期的雄性河蟹副性腺蛋白質(zhì)種類變化不大，只是成熟雄性河蟹副性腺在66.4～97.2kDa間的蛋白條帶的表達(dá)量多于其他未成熟時(shí)期的雄性河蟹。本研究沒有具體分析這些蛋白質(zhì)對雄性生殖的作用以及在雄性河蟹成熟過程中的作用。

正常和早熟雄性河蟹的副性腺蛋白質(zhì)種類和分布無明顯差異，但是,早熟雄性河蟹副性腺中分子量在66.4～97.2kDa間的蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯少于正常雄性河蟹副性腺的蛋白表達(dá)量，這一區(qū)域的未成熟時(shí)期的雄性河蟹的蛋白表達(dá)量也少于成熟雄性河蟹副性腺。由此可以推出，雖然早熟雄性河蟹性腺已發(fā)育成熟，但是分子量在66.4～97.2kDa間的副性腺蛋白表達(dá)量仍然低于正常雄性河蟹，而這一區(qū)別可能對性腺的發(fā)育沒有影響，但可能影響機(jī)體中其他組織器官的生長發(fā)育，成為早熟雄性河蟹性腺發(fā)育成熟但個(gè)體較小且死亡率高的原因之一。

在本研究中，正常雄性河蟹血淋巴中睪酮和17β-雌二醇的濃度都維持在一個(gè)較高的水平，顯著高于早熟雄性河蟹。由此可知，雖然早熟雄性河蟹性腺已經(jīng)發(fā)育成熟，但是激素水平與正常雄性河蟹相比仍然較低，可能影響機(jī)體中其他組織器官的生長發(fā)育，影響河蟹機(jī)體的生長，是早熟雄性河蟹性腺提早發(fā)育成熟但是個(gè)體仍然較小且死亡率高的原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，早熟雄性河蟹分子量在66.4～97.2kDa間的副性腺蛋白的表達(dá)量明顯少于正常雄性河蟹，早熟雄性河蟹血淋巴中睪酮和17β-雌二醇的濃度顯著低于正常雄性河蟹。由此說明分子量在66.4～97.2kDa間的副性腺蛋白，睪酮及17β-雌二醇這兩種激素，與河蟹性早熟有一定的關(guān)聯(lián)，與早熟雄性河蟹性腺提早發(fā)育成熟，進(jìn)而導(dǎo)致其個(gè)體較小且死亡率高有關(guān)，從而為進(jìn)一步研究河蟹性早熟機(jī)理、預(yù)防河蟹性早熟提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

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