王天浩 閆飛 袁建林 魏迪 朱政 來(lái)東 李西安

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科, 陜西 西安 710000)

腎透明細(xì)胞癌是臨床常見的泌尿系惡性腫瘤之一，是腎臟惡性腫瘤最為常見的類型，惡性程度較高，且癌細(xì)胞容易脫落而轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。近年其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，因此，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究成為學(xué)界和臨床的焦點(diǎn)問(wèn)題[1-4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，多種腎透明細(xì)胞癌的相關(guān)腫瘤分子標(biāo)志物被逐步確立，而作為細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì)線粒體DNA(mtDNA)，由于容易發(fā)生突變，其與癌癥發(fā)病的聯(lián)系受到重視[5-8]。D-loop在內(nèi)的非編碼區(qū)域是mtDNA多態(tài)性熱點(diǎn)區(qū)域，據(jù)相關(guān)研究表明該區(qū)域與多種腫瘤的發(fā)病和預(yù)后有關(guān)[9-12]， 故本文探討了線粒體DNA(mtDNA)D-loop基因多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系，為臨床研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年3月～2017年2月在我院治療的腎透明細(xì)胞癌患者63例為觀察組，其中男性39例，女性24例；年齡34～68歲，平均年齡(50.17±9.22)歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)診斷。②術(shù)前未接受化療、放療等治療。③臨床隨訪資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能隨訪者。②合并其他原發(fā)性腫瘤者。同時(shí)選取健康志愿者70例作為對(duì)照，其中男性40例，女性30例；年齡32～70歲，平均年齡(49.83±8.17)歲；觀察組和對(duì)照組受試者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 所有患者術(shù)前均空腹抽取外周靜脈血，外周血標(biāo)本當(dāng)天提取DNA后置于-80℃恒溫冰箱保存。

1.2.2 引物合成及PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)擴(kuò)增 mtDNAD-loop區(qū)的引物沒(méi),上游引物：5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3'；下游引物：5'-GCTTTGAGGAGGTAAGCTAC-3'。引物合成和純化均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。PCR 反應(yīng)采用25μL 反應(yīng)體積。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min,95℃變形30s，55℃退火30 s，72℃延伸1min，38個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸 5 min。

1.2.3 DNA測(cè)序及結(jié)果分析 將 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，用 ABIPRISM 3100 DNA 序列分析儀對(duì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，利用 DNAman 軟件分析腎透明細(xì)胞癌患者的mtDNAD-loop區(qū)序列，并與人mtDNA文庫(kù)記錄的劍橋序列(rCRS)進(jìn)行比對(duì)，篩選出 mtDNAD-loop區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件，樣本代表性采用Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較使用t檢驗(yàn)，生存曲線采用Kaplan-Meier描繪法，比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mtDNAD-loop基因多態(tài)性位點(diǎn)分布 觀察組和對(duì)照組mtDNAD-loop區(qū)共發(fā)現(xiàn)135個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中9個(gè)位點(diǎn)分布頻率>5%，包括262、488、523、525、16293、16298、16304、16362和16519。根據(jù)Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗(yàn)，最后發(fā)現(xiàn)觀察組和對(duì)照組262位點(diǎn)基因型頻率分布符合Hardy-Wenberg定律，其樣本代表性好，其余位點(diǎn)基因型頻率分布不符合Hardy-Wenberg定律。

2.2 兩組mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較 觀察組和對(duì)照組mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中觀察組TT基因型及等位基因T頻率分布為19.05%和38.89%，明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

2.3 mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、病理分級(jí)和臨床分期腎透明細(xì)胞癌患者mtDNAD-lOOP區(qū)262位點(diǎn)基因多態(tài)性分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4 mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與預(yù)后關(guān)系 截止2017年9月，CC基因型和CT基因型患者中位生存時(shí)間分別為40.40個(gè)月和40.20個(gè)月，明顯高于TT基因型患者的34.81個(gè)月，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=25.585，P<0.05)，見圖1。

表2 mtDNA D-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與臨床病理特征的關(guān)系[n(×10-2)] Table 2 The relationship between polymorphism of 262 locus in mtDNA D-loop region and clinicopathological features

圖1 生存曲線圖 Figure 1 Survival graph

3 討論

線粒體是真核細(xì)胞的重要細(xì)胞器之一，是呼吸和氧化的中心，并且其攜帶了部分DNA,即線粒體DNA(mtDNA),是細(xì)胞核外唯一的遺傳物質(zhì), 由16568個(gè)堿基對(duì)組成，含有3個(gè)基因，其中13個(gè)為蛋白質(zhì)基因，2個(gè)為 rRNA基因， 22個(gè)為tRNA基因[13-15]。mtDNA處于活性氧及其他自由基包圍之中，且缺乏相應(yīng)組蛋白的保護(hù)以及完整的內(nèi)修復(fù)系統(tǒng)，與核內(nèi)基因組相比，mtDNA較易發(fā)生突變[16-17]。mtDNA的多態(tài)性熱點(diǎn)區(qū)域主要集中在包括D-loop在內(nèi)的非編碼區(qū)域，D-loop區(qū)是mtDNA復(fù)制的調(diào)控區(qū)域，所以該區(qū)域DNA的復(fù)制和表達(dá)異常，往往與多種腫瘤的病發(fā)和預(yù)后具有相關(guān)性[18-20]?；蚨鄳B(tài)性是指由于單個(gè)核苷酸變異，引起染色體基因組水平上的DNA序列呈多態(tài)性，成為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)標(biāo)志和微衛(wèi)星標(biāo)志發(fā)現(xiàn)后的第三代標(biāo)志物，可能與多種腫瘤的病發(fā)和預(yù)后有關(guān)[21-22]。

3.1 mtDNAD-loop基因多態(tài)性位點(diǎn)分布分析 本文采用Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，現(xiàn)結(jié)果如下：觀察組和對(duì)照組mtDNAD-loop區(qū)共發(fā)現(xiàn)135個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，根據(jù)Hardy-Wenberg遺傳平衡檢驗(yàn)，最后發(fā)現(xiàn)觀察組和對(duì)照組262位點(diǎn)基因型頻率分布符合Hardy-Wenberg定律，其樣本代表性好，因此本文選用mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)基因型頻率為研究對(duì)象。

3.2 兩組mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較分析 mtDNAD-loop區(qū)的基因呈多態(tài)性，可能與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病有相關(guān)性，因此本文以262位點(diǎn)基因型及等位基因頻率為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)觀察組和對(duì)照組mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中觀察組TT基因型及等位基因T頻率分布明顯高于對(duì)照組，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這表明mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)TT基因及等位基因T與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病具有相關(guān)性，在一定程度上解釋了腎透明細(xì)胞癌的在基因水平的部分發(fā)病機(jī)制。

3.3 mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與臨床病理特征的關(guān)系分析 為了排除其他因素對(duì)mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌相關(guān)性的干擾，本文研究了不同性別、年齡、病理分級(jí)和臨床分期腎透明細(xì)胞癌患者mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)基因多態(tài)性分布，發(fā)現(xiàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明了性別、年齡、病理分級(jí)和臨床分期等因素與mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性不具相關(guān)性，進(jìn)一步確定了其與腎透明細(xì)胞癌發(fā)病密切相關(guān)。

3.4 mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與預(yù)后關(guān)系分析 據(jù)相關(guān)研究表明，mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后具有相關(guān)性，因此本文研究了二者的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CC基因型和CT基因型患者中位生存時(shí)間明顯高于TT基因型患者，差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)TT基因型不利患者預(yù)后的改善，從而縮短患者的生存周期。

4 結(jié)論

本文探討了mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)的多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系，從基因水平對(duì)腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行考察，顯示腎透明細(xì)胞癌患者mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)攜帶等位基因T的頻率明顯升高，明確了mtDNAD-loop區(qū)262位點(diǎn)多態(tài)性與腎透明細(xì)胞癌發(fā)病的相關(guān)性。但其與臨床病理特征無(wú)明顯關(guān)系，有先進(jìn)進(jìn)一步研究。

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