癌組織中CD45RO表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征及生存率的關(guān)聯(lián)分析

俞達(dá)輝，吳道立，袁沖，褚文炎

（余姚市人民醫(yī)院心胸外科，浙江 余姚 315400）

肺癌是全球惡性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康和生命。肺腺癌是其最常見的組織學(xué)亞型[1]。隨著手術(shù)治療、放化療、靶向治療以及免疫治療等多種治療手段的應(yīng)用和發(fā)展，肺腺癌患者的療效有所提高，但其5年總生存率仍然為4%～17%[2]。

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞 （tumor-infiltrating lymphocyte，TILs） 作為一類由不同細(xì)胞構(gòu)成的異質(zhì)細(xì)胞群，可浸入腫瘤組織直接反映宿主與腫瘤之間的免疫應(yīng)答狀態(tài)[3]。CD45分子，即蛋白絡(luò)氨酸磷酸酶受體C型，可作為T淋巴細(xì)胞亞群的分類標(biāo)志。CD45RO+記憶T細(xì)胞是較常見的T細(xì)胞亞型，有強(qiáng)大的自我更新能力，可在再次接觸抗原后產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，從而在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起著重要作用[4]。然而，關(guān)于CD45RO表達(dá)水平在肺腺癌患者中的作用目前尚不明確。因此，本研究旨在評估腫瘤組織CD45RO表達(dá)水平與肺腺癌手術(shù)患者的臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性隊列研究設(shè)計，連續(xù)納入了121例2009年3月至2012年2月于余姚市人民醫(yī)院心胸外科接受開胸手術(shù)治療的肺腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)為： （1） 所有患者均根據(jù)其臨床特征、影像學(xué)檢查和病理證實確診為肺腺癌； （2） 所有患者術(shù)前未進(jìn)行任何新輔助治療 （包括新輔助化療、放療等），且均接受了肺部手術(shù)治療； （3） 所有患者年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)： （1） 有嚴(yán)重感染、嚴(yán)重肝功能異常或嚴(yán)重腎功能異?；颊?，合并其他惡性腫瘤的患者或有其他惡性腫瘤史的患者； （2） 預(yù)期生命值<12個月患者； （3）有認(rèn)知障礙或其他因素導(dǎo)致預(yù)估難以執(zhí)行定期隨訪和評估的患者。本研究經(jīng)過余姚市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署了知情同意書。手術(shù)中采集肺腺癌組織和癌旁組織標(biāo)本，然后采用福爾馬林浸泡并石蠟封存以備后期使用。

1.2 臨床病理特征采集和隨訪

采集所有患者的基線期人口學(xué)、臨床和病理特征信息 （包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、腫瘤大小和TNM分期） ，按照第6版AJCC腫瘤分期手冊進(jìn)行TNM分期評估。所有患者手術(shù)后均接受輔助化療：長春瑞濱25 mg/m2d1和d8，順鉑75 mg/m2d1，q3w 治療3～4個療程。隨訪截止日期為2017年2月，中位隨訪期為44個月?；颊咝g(shù)后6個月每月隨訪1次；6個月到2年每3月隨訪1次；之后每6月隨訪1次。無病生存期 （disease free survival，DFS）和總體生存期 （overall survival，OS） 是根據(jù)患者疾病復(fù)發(fā)、死亡和/或最終隨訪時間計算的。

1.3 免疫組化

采用anti-CD45RO抗體 （Abcam） 對組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色： （1） 對石蠟切片進(jìn)行脫蠟；加入修復(fù)液Tris-EDTA （pH = 9.0） 進(jìn)行抗原修復(fù)；加入3%的過氧化氫溶液進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷；將其浸入4%牛血清白蛋白進(jìn)行非特異性內(nèi)源性抗原的阻斷。 （2） 加入anti-CD45RO抗體，同時將其置于4℃冰箱里孵育過夜；洗后，加入辣根過氧化物酶 （合）共軛anti-IgG （Abcam） 對其再次進(jìn)行孵育，同時室溫靜置30 min。 （3） 清洗和DAB處理；加樣器加入蘇木精進(jìn)行復(fù)染。 （4） 脫水，封片。

2位病理科醫(yī)師采用雙盲法分別利用光學(xué)顯微鏡對其陽性細(xì)胞進(jìn)行觀察閱片。每張切片隨機(jī)觀察視野腫瘤細(xì)胞，計算100個細(xì)胞/視野染色陽性的細(xì)胞比，在高倍鏡視野下 （高通濾波器，400倍） 。陽性細(xì)胞所占比例評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分 （0%） 、1分（>0%～25%） 、2分 （>25%～50%） 、3分 （>50%～75%） 和4分 （>75%～100%） 。CD45RO以胞質(zhì)出現(xiàn)淺黃色至棕褐色者為陽性，染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：基本不著色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕褐色為3分。最后，計算染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)和染色面積分?jǐn)?shù)的乘積得到總表達(dá)評分，并進(jìn)行分組：低 （0～3分） 、中 （4～6分） 、高 （> 6分） 。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)展示形式主要為±s和百分比表示。采用χ2檢驗比較肺腺癌組織和癌旁組織CD45RO表達(dá)水平差異；采用Pearson檢驗分析肺腺癌組織CD45RO水平與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)；采用Kaplan-Meier （K-M） 曲線和Log-rank檢驗分析肺腺癌組織CD45RO表達(dá)與DFS及OS的關(guān)聯(lián)；采用單因素和多因素COX風(fēng)險比回歸模型進(jìn)行基線期因素對于DFS及OS的預(yù)測作用分析。P> 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線期信息

本研究納入121例肺腺癌手術(shù)患者，其中男69例、女52例；平均年齡 （62.97±9.87） 歲；腫瘤大小≤5 cm 68例 （56.2%） 、>5 cm 53例 （43.8%） ；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者71例 （58.7%） 、陽性50例 （41.3%） ；遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移陰性患者119例 （98.3%） 、陽性2例 （1.7%） 。見表1。

2.2 CD45RO在肺腺癌組織中高表達(dá)

表1 肺腺癌患者基線期信息Tab.1 Baseline characteristics in surgical patients with LAC

免疫組織化學(xué)染色顯示，CD45RO相對于癌旁組織在肺腺癌組織中高表達(dá)，見圖1，表2。肺腺癌組織和癌旁組織中高、中、低表達(dá)CD45RO在肺腺癌組織中的數(shù)量分別為82、68、30，然而其表達(dá)在癌旁組織中的數(shù)量分別為17、59、104；2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P< 0.001） ，見表2。

圖1 免疫組化顯示CD45RO在肺腺癌組織中高表達(dá)Fig.1 High CD45RO expression in tumor tissue samples

2.3 肺腺癌組織中CD45RO表達(dá)水平與腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)

腫瘤組織CD45RO表達(dá)水平與腫瘤大小 （r=-0.198，P= 0.029） 、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （r= -0.184，P= 0.043）均呈負(fù)相關(guān)。見表2。

2.4 肺腺癌組織中CD45RO表達(dá)水平與DFS及OS的關(guān)聯(lián)

采用K-M曲線和Log-rank檢驗分析肺腺癌組織CD45RO表達(dá)與DFS及OS的關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示肺腺癌組織中的CD45RO表達(dá)水平越高，DFS （P< 0.001）和OS （P< 0.001） 越長，見圖2。

2.5 肺腺癌患者DFS和OS的預(yù)后因素分析

采用單因素COX風(fēng)險回歸模型分析肺腺癌組織CD45RO表達(dá)水平以及臨床病理特征分別對于其手術(shù)患者DFS和OS影響，顯示腫瘤組織CD45RO表達(dá)量與患者較好的DFS顯著相關(guān) （P< 0.001） 。然而，低分化 （P= 0.046） 、淋巴轉(zhuǎn)移 （P< 0.001） 及TNM分級 （P= 0.003） 與患者較差的DFS顯著相關(guān)。進(jìn)一步采用多因素COX回歸模型分析肺腺癌手術(shù)患者DFS的獨立預(yù)測因素，發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織CD45RO表達(dá)量（P< 0.001） 能獨立預(yù)測其患者良好的DFS，然而，低分化 （P= 0.017） 和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （P= 0.004） 均能獨立預(yù)測肺腺癌手術(shù)患者不良的DFS。見表3。

表2 CD45RO表達(dá)水平和患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)Tab.2 Correlation of CD45RO expression with clinicopathological properties

圖2 CD45RO表達(dá)水平與DFS以及OS的Kaplan-Meier曲線分析Fig.2 Kaplan-Meier curve for Correlations of CD45RO expression with DFS and OS

表3 肺腺癌患者DFS預(yù)后因素分析Tab.3 Analysis of predictive factors for DFS in patients with LAC

單因素COX分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織CD45RO表達(dá)量與患者較好的OS （P< 0.001） 有關(guān)，而低分化（P= 0.003） 、淋巴轉(zhuǎn)移 （P< 0.001） 、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 （P=0.029） 及TNM分級 （P= 0.001） 均與患者較差的OS有關(guān)。多因素COX分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織CD45RO表達(dá)量 （P< 0.001） 能獨立預(yù)測其手術(shù)患者良好的OS，而低分化 （P= 0.001） 、淋巴轉(zhuǎn)移 （P< 0.001） 及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移 （P= 0.001） 均能獨立預(yù)測其手術(shù)患者較差的OS。其他臨床病理特征對OS的預(yù)測作用，見表4。

表4 肺腺癌患者OS預(yù)后因素分析Tab.4 Analysis of predictive factors for OS in patients with LAC

3 討論

多種TILs，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞以及樹突細(xì)胞等，可通過特異性識別和清除機(jī)體腫瘤細(xì)胞，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程[5]。其中CD45RO+TILs被發(fā)現(xiàn)在胃癌以及喉癌中呈高表達(dá)水平[4，6]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)。這可能是因為腫瘤發(fā)生與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，腫瘤微環(huán)境中存在大量的白細(xì)胞，從而在所有白細(xì)胞上均有表達(dá)，且也稱為白細(xì)胞共同抗原（leukocyte common antigen，LCA） 的CD45被更多的發(fā)現(xiàn)[7]。

CD45是一類結(jié)構(gòu)相似的跨膜蛋白組成的分子，由PRPRC基因編碼[8]。CD45RO記憶T細(xì)胞再次接觸到腫瘤細(xì)胞時，可快速發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，繼而殺傷腫瘤細(xì)胞[7]。研究[9]表明，CD45RO通過激活白細(xì)胞介素2 （interleukin-2，IL-2） 、干擾素γ （interferon-γ，IFN-γ） 以及腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 來抵抗宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移，繼而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。同時，CD45RO+記憶T細(xì)胞減少高遷移率族蛋白B1 （high-mobility group box 1，HMGB1） 的生成，抑制晚期結(jié)腸癌患者腫瘤細(xì)胞增殖分化和遷徙[10]。此外，CD45RO+TILs的表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌患者的低分化和TMN分級、乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤大小、結(jié)腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血管侵襲均呈負(fù)相關(guān)[11-13]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)，這可能是由于CD45RO可調(diào)節(jié)多種效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，發(fā)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答來殺傷腫瘤細(xì)胞從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[9-10]。

一些研究[14]評估了CD45RO與惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。乳腺癌患者中CD45RO高表達(dá)組的腫瘤復(fù)發(fā)率低于低表達(dá)組。且CD45RO高表達(dá)水平已被證實與腎細(xì)胞癌以及胃癌患者良好的DFS和OS均密切相關(guān)[12，15]。本研究有相似的發(fā)現(xiàn)。這可能是因為CD45RO能促進(jìn)大量效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，殺傷腫瘤細(xì)胞來抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，繼而影響患者的預(yù)后情況[9-10]。

本研究仍有有一些不足： （1） 主要納入了可接受肺腺癌手術(shù)的Ⅰ～Ⅲ期的患者 （Ⅳ期患者僅2例），因此CD45RO表達(dá)水平在肺腺癌Ⅳ期患者的預(yù)后作用尚不明確； （2） 對肺腺癌患者組織樣本CD45RO的表達(dá)量進(jìn)行了鑒定，而未對血液中CD45RO表達(dá)量進(jìn)行評估； （3） 樣本量相對較小。故進(jìn)一步的研究需要擴(kuò)大樣本容量并且同時納入肺腺癌Ⅳ期患者且采集患者血液樣本。

綜上所述，本研究表明，腫瘤組織中CD45RO表達(dá)水平可作為新穎且可靠的生物標(biāo)志物，用于評估肺腺癌手術(shù)患者的臨床病理特征和預(yù)后情況。

[1]CANCER GENOME ATLAS RESEARCH N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma [J]. Nature，2014，511 （7511） ：543-550. DOI：10.1038/nature13385.

[2]HERBST RS，HEYMACH JV，LIPPMAN SM. Lung cancer [J]. N Engl J Med，2008，359 （13） ：1367-1380. DOI：10.1056/NEJMra0802714.

[3]ANDERSEN R，DONIA M，WESTERGAARD MC，et al. Tumor infiltrating lymphocyte therapy for ovarian cancer and renal cell carcinoma [J]. Hum Vaccin Immunother，2015，11 （12） ：2790-2795. DOI：10.1080/21645515.2015.1075106.

[4]李滿意，劉濟(jì)生，周慧，等. CD45RO在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2014，28 （6） ：373-375，380. DOI：10.13201/j.issn.1001-1781.2014.06.005.

[5]HALL M，LIU H，MALAFA M，et al. Expansion of tumor-infiltrating lymphocytes （TIL） from human pancreatic tumors [J]. J Immunother Cancer，2016，4 （1） ：61. DOI：10.1186/s40425-016-0164-7.

[6]OSINSKY S，KOVELSKAYA A，BUBNOVSKAYA L，et al. CD8 and CD45RO T lymphocytes in bone marrow of gastric cancer patients：correlation with disseminated tumor cells and disease outcome [J].Exp Oncol，2015，37 （1） ：48-52.

[7]POLLARD JW. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis [J]. Nat Rev Cancer，2004，4 （1） ：71-78.DOI：10.1038/nrc1256.

[8]SALLUSTO F，GEGINAT J，LANZAVECCHIA A. Central memory and effector memory T cell subsets：function，generation，and maintenance [J]. Annu Rev Immunol，2004，22 （1） ：745-763. DOI：10.1146/annurev.immunol.22.012703.104702.

[9]RANGEL R，ROCHA L，RAMIREZ JL，et al. Generation of memory CD4+，CD8+，CD45RO+ and CD16-lymphocytes activated with IL-2，INF-gamma，and TNF-alpha with specific cytotoxicity against autologous cervical cancer cells in a mixed leukocyte-tumour cell culture [J].Eur Cytokine Netw，1995，6 （3） ：195-202.

[10]PENG RQ，WU XJ，DING Y，et al. Co-expression of nuclear and cytoplasmic HMGB1 is inversely associated with infiltration of CD45RO+ T cells and prognosis in patients with stageⅢB colon cancer [J]. BMC Cancer，2010，10：496. DOI：10.1186/1471-2407-10-496.

[11]YAJIMA R，YAJIMA T，F(xiàn)UJII T，et al. Tumor-infiltrating CD45RO（+） memory cells are associated with a favorable prognosis breast cancer [J]. Breast Cancer，2016，23 （4） ：668-674. DOI：10.1007/s12282-015-0622-y.

[12]HOTTA K，SHO M，F(xiàn)UJIMOTO K，et al. Prognostic significance of CD45RO+ memory T cells in renal cell carcinoma [J]. Br J Cancer，2011，105 （8） ：1191-1196. DOI：10.1038/bjc.2011.368.

[13]KOELZER VH，LUGLI A，DAWSON H，et al. CD8/CD45RO T-cell infiltration in endoscopic biopsies of colorectal cancer predicts nodal metastasis and survival [J]. J Transl Med，2014，12：81. DOI：10.1186/1479-5876-12-81.

[14]SALGADO R，DENKERT C，DEMARIA S，et al. The evaluation of tumor-infiltrating lymphocytes （TILs） in breast cancer：recommendations by an international TILs working group 2014 [J]. Ann Oncol，2015，26 （2） ：259-271. DOI：10.1093/annonc/mdu450.

[15]WAKATSUKI K，SHO M，YAMATO I，et al. Clinical impact of tumor-infiltrating CD45RO （+） memory T cells on human gastric cancer [J]. Oncol Rep，2013，29 （5） ：1756-1762. DOI：10.3892/or.2013.2302.