白　茹，孫志紅，位　杰

(1.石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003； 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000； 3.新疆兵團(tuán)第二師農(nóng)業(yè)科學(xué)所，新疆 庫(kù)爾勒 841000)

溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要生態(tài)因子，低溫是植物常遇到的一種逆境，不僅影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植物死亡。庫(kù)爾勒香梨作為新疆傳統(tǒng)的地方果樹品種，栽培歷史悠久，是當(dāng)?shù)毓r(nóng)重要的經(jīng)濟(jì)收入來源之一。但是，2000年以來，低溫凍害造成許多香梨樹大面積死亡，給廣大果農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]，保障香梨安全越冬成為目前栽培管理的重要任務(wù)之一。因此，研究庫(kù)爾勒香梨越冬期的生理生化特征變化具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護(hù)酶、相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛等與植物抵御凍害的能力密切相關(guān)[2-3]。植物在越冬過程中生理指標(biāo)會(huì)出現(xiàn)不同的變化。趙樹亮[4]研究發(fā)現(xiàn)，越橘在自然越冬過程中，可溶性糖含量積累主要發(fā)生在越冬前期，脯氨酸含量最大值出現(xiàn)在溫度回升初期。何西風(fēng)[5]在花椒的自然越冬抗寒性研究中發(fā)現(xiàn)，脯氨酸對(duì)抗寒性的提高有滯后性。自然條件下庫(kù)爾勒香梨經(jīng)歷由秋季到冬季的寒冷適應(yīng)后進(jìn)入休眠狀態(tài)，在此過程中，枝條在生理上如何適應(yīng)這樣的低溫變化，香梨在何時(shí)最容易受到凍害威脅，是需要關(guān)注的主要問題。鑒于此，針對(duì)庫(kù)爾勒香梨枝條的細(xì)胞膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、抗氧化酶活性等生理指標(biāo)在秋冬季的變化，研究香梨在自然降溫過程中的生理特點(diǎn)，探明庫(kù)爾勒香梨枝條對(duì)低溫變化的生理適應(yīng)性，并利用隸屬函數(shù)法對(duì)庫(kù)爾勒香梨不同月份抵御凍害的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為香梨凍害機(jī)制研究和香梨安全越冬管理提供科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)。

1　材料和方法

1.1　材料

選擇庫(kù)爾勒地區(qū)生長(zhǎng)勢(shì)均衡的30株初果期的庫(kù)爾勒香梨樹，于2015年11月1日到2016年3月1日期間，每隔15 d采樣 1 次，每次采集120個(gè)枝條，保留枝條中部4節(jié)。采樣時(shí)，隨機(jī)從樹體外圍東、南、西、北4個(gè)方向，選取無病蟲害、充分成熟、粗度 0.5 cm 左右的1年生枝條，立即蠟封剪口，帶回實(shí)驗(yàn)室用于生理指標(biāo)的測(cè)定。在采樣期間利用高低溫度計(jì)測(cè)定和記錄采樣地每日最高、最低氣溫，并計(jì)算出半月平均最高、最低氣溫。

1.2　方法

1.2.1生理指標(biāo)的測(cè)定參照撒俊逸等[6]的方法測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率；參考孫群等[7]的方法測(cè)定可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，參考Bai等[8]的方法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性；采用硫代巴比妥酸顯色法測(cè)定丙二醛(MDA)含量[9]，每個(gè)指標(biāo)測(cè)定均重復(fù)3次。

1.2.2枝條抵御凍害能力的綜合評(píng)價(jià)采用隸屬函數(shù)值法[10]對(duì)庫(kù)爾勒香梨越冬期不同月份枝條抵御凍害的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定值采用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換，對(duì)所測(cè)的生理指標(biāo)用下式求出各個(gè)時(shí)期被測(cè)指標(biāo)的隸屬度。

(1)與抗寒性呈正相關(guān)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、保護(hù)酶活性按以下公式計(jì)算：

U(Xi)=(Xi-Xi min)/(Xi max-Xi min)，Δ=1/n∑U(Xi)

(2)與抗寒性呈負(fù)相關(guān)的相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛含量按以下公式計(jì)算：

U(Xi)=1-(Xi-Xi min)/(Xi max-Xi min)，Δ=1/n∑U(Xi)

其中，n為測(cè)定的指標(biāo)總數(shù)；Ui為第i個(gè)測(cè)定指標(biāo)；U(Xi)∈[0，1]；Δ為不同采樣期各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定的綜合評(píng)定結(jié)果。Xi max、Xi min為不同采樣期第i項(xiàng)指標(biāo)的最大值和最小值。

1.3　數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　采樣地環(huán)境溫度變化

采樣地2015年11月1日到2016年3月1日半月平均最低、最高溫度見表1。由表1可以看出，采樣地溫度從2015年11月1日開始逐漸降低，到2016年2月1日溫度降到最低，半月平均最低溫度為-14.75 ℃，之后溫度開始逐漸上升。

表1　采樣地采樣期間半月平均溫度　℃

2.2　越冬期庫(kù)爾勒香梨枝條相對(duì)電導(dǎo)率的變化

由圖1可以看出，從11月到翌年3月，自然越冬香梨枝條的相對(duì)電導(dǎo)率由38.93%上升到最高點(diǎn)55.82%(2月1日)，之后，隨著溫度的回升，電解質(zhì)滲出率開始降低，相對(duì)電導(dǎo)率下降。

不同小寫字母表示不同采樣時(shí)間間差異顯著(P<0.05)，下同圖1　越冬過程中庫(kù)爾勒香梨枝條相對(duì)電導(dǎo)率的變化

2.3　越冬期庫(kù)爾勒香梨枝條MDA含量的變化

由圖2所示，從11月至翌年3月，香梨枝條的MDA含量總體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，11月初到 12月底上升緩慢，翌年1月后隨著溫度的極劇下降，MDA含量上升幅度加大，最寒冷的2月初，其含量較越冬初期的11月上升了52.93%。

圖2　越冬過程中庫(kù)爾勒香梨枝條MDA含量的變化

2.4　越冬期庫(kù)爾勒香梨枝條滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

從圖3可以看出， 2015年11月1日至2015年12月15日，越冬期香梨枝條可溶性糖含量隨著氣溫的降低而升高，之后的12月15日到翌年1月1日，隨著溫度的下降，可溶性糖含量雖然出現(xiàn)了下降，但較越冬初期，其含量仍高于越冬初期0.15%，之后隨著溫度的降低其含量又開始上升，在2月15日含量達(dá)到最大，為1.2%。在整個(gè)越冬期間，香梨枝條可溶性蛋白含量總體呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)，在2016年溫度最低的1月1日到2月1日，可溶性蛋白含量降到了整個(gè)越冬期最低，達(dá)到0.48 μg/g左右，與其他時(shí)期差異顯著，越冬后期，可溶性蛋白含量出現(xiàn)增加，到3月1日含量達(dá)到最高，為0.77 μg/g，與越冬初期(2015年11月1日)差異顯著。在整個(gè)越冬期，香梨枝條脯氨酸含量的變化趨勢(shì)是先升高后降低。從2015年11月1日開始香梨枝條脯氨酸含量隨著外界環(huán)境溫度的降低而漸漸升高，到12月1日，達(dá)到全年最高28.04 μg/g；之后，隨著環(huán)境溫度的降低，脯氨酸含量開始降低，2016年2月15日，含量最低到14.04 μg/g，雖然之后又出現(xiàn)了小幅上升，但含量仍低于越冬初期。

圖3　越冬過程中庫(kù)爾勒香梨枝條可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量的變化

2.5　越冬過程中庫(kù)爾勒香梨枝條保護(hù)酶活性的變化

由圖4可以看出，在越冬期，香梨枝條SOD活性變化趨勢(shì)是先升高后降低。從2015年11月1日開始香梨枝條SOD活性隨著外界環(huán)境溫度的降低而漸漸升高，到12月1日，達(dá)到全年最高(392.32 U/g)；之后，隨著環(huán)境溫度的降低，SOD活性開始下降，到2016年3月1日，含量降到全年最低(86.6 U/g)。越冬期，香梨枝條POD活性呈現(xiàn)不規(guī)律小幅上升或下降趨勢(shì)，雖然在溫度最低的1月和2月，其活性最低，但與其他時(shí)期相比，差異并不顯著。在越冬期，香梨枝條CAT活性變化趨勢(shì)是先升高后降低。2015年11月1日至12月1日，香梨枝條CAT活性隨著外界環(huán)境溫度的降低而漸漸升高，12月1日達(dá)到全年最高[4.58 μmol/(g·min)]；之后，隨著環(huán)境溫度的降低，CAT活性開始下降，到2016年2月15日，含量降到全年最低[2.46 μmol/(g·min)]。

圖4　越冬過程中庫(kù)爾勒香梨枝條SOD、POD、CAT活性的變化

2.6　越冬期庫(kù)爾勒香梨不同月份枝條抵御凍害的能力評(píng)價(jià)

由表2可知，庫(kù)爾勒香梨在自然越冬期，不同時(shí)期枝條抵御凍害的能力有很大的差異。在氣溫開始下降的11月到12月，平均隸屬度出現(xiàn)上升，枝條抵御凍害的能力開始加強(qiáng)，12月15日達(dá)到最大，為0.800 7。之后的1月到2月中旬隨著氣溫的急劇下降，香梨生理指標(biāo)平均隸屬度也開始下降，2月1日達(dá)到最小，為0.205 5，枝條抵御凍害的能力降到最低。之后隨著氣溫的回升，平均隸屬度開始上升，枝條開始逐漸恢復(fù)對(duì)凍害的抵御能力。

表2　庫(kù)爾勒香梨各生理指標(biāo)的隸屬度及枝條抵御凍害能力的綜合評(píng)定

3　結(jié)論與討論

3.1　自然越冬過程中庫(kù)爾勒香梨抗寒性生理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

用電解質(zhì)滲出率反映植物在低溫脅迫下細(xì)胞膜透性的變化是鑒定植物抗寒性較直觀的辦法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[11]。果樹在低溫逆境中過多的活性氧易誘發(fā)膜脂過氧化，引發(fā)過氧化產(chǎn)物如MDA等的大量積累，因而MDA的產(chǎn)生量亦成為了鑒別逆境傷害的指標(biāo)之一[12]，通過測(cè)定MDA含量的變化能夠反映植物細(xì)胞發(fā)生膜脂過氧化的劇烈程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱[13]。本研究結(jié)果表明，自然越冬過程中，隨著氣溫的降低，香梨枝條電解質(zhì)滲出率和MDA含量逐漸增加，表明外界氣溫越低，細(xì)胞膜透性程度越高，枝條所受的傷害越重，這與撒俊逸等[6]的研究結(jié)果一致。

低溫會(huì)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，提高細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度，降低水勢(shì)，從而保持植物的正常生長(zhǎng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在越冬初期，隨著外界環(huán)境溫度的降低，香梨枝條可溶性糖和脯氨酸含量逐漸升高，之后隨著氣溫的急劇下降，二者的含量出現(xiàn)了降低，但均比越冬初期高，在越冬后期，氣溫回升，二者的含量又開始升高，由此可以看出，雖然香梨枝條在越冬期細(xì)胞膜受到了低溫的傷害，但自身可以通過可溶性糖和脯氨酸的積累來降低冰點(diǎn)，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，并對(duì)細(xì)胞膜起保護(hù)作用，避免了枝條死亡。

有關(guān)研究表明，植物在抗冷過程中形成了大量新的蛋白質(zhì)，直接參與植物的抗寒過程，尤其是可溶性蛋白與抗寒性的關(guān)系更為密切[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在越冬期開始時(shí)，香梨枝條可溶性蛋白含量很高，說明越冬前香梨枝條已積累了大量的蛋白質(zhì)來抵御寒冷脅迫。隨著外界氣溫的下降，可溶性蛋白含量比越冬初期降低，在溫度最低的月份，其含量降到了整個(gè)越冬期最低，可能是因?yàn)橄憷嬷l可溶性蛋白累積速率小于分解速率，導(dǎo)致在溫度降低時(shí)可溶性蛋白含量逐漸下降。

在生物進(jìn)化過程中，細(xì)胞形成了SOD、POD、CAT等清除自由基和活性氧的保護(hù)系統(tǒng)，它們?cè)谥参矬w內(nèi)協(xié)同發(fā)揮作用，清除過多的自由基，使生物自由基維持在一個(gè)較低的水平，從而防止自由基的毒害，以保護(hù)細(xì)胞膜不受到傷害。這些保護(hù)酶系統(tǒng)雖不能直接判斷植物的抗寒性強(qiáng)弱，但都與抗寒性有密切的關(guān)系[16-17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，越冬期香梨枝條SOD、POD、CAT活性隨著氣溫的降低變化相似，較強(qiáng)冷空氣來襲前都出現(xiàn)了大量的積累，之后隨著氣溫的繼續(xù)下降，其活性開始降低，這可能是由于溫度的降低加重了細(xì)胞膜的受害程度，高濃度的自由基導(dǎo)致了酶蛋白分子的破壞，從而降低了其活性[18]。

2015年11月到2016年3月的自然降溫過程中，香梨枝條相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量隨著天氣的變冷而升高，它們?cè)谝欢ǔ潭壬戏从沉酥l細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損害程度。在氣溫下降到-10 ℃以下之前(1月1日前)，枝條的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量上升緩慢，這可能是由于在較強(qiáng)冷空氣來襲前的這段時(shí)間，香梨枝條的可溶性糖、脯氨酸SOD、POD、CAT出現(xiàn)了大量積累，可溶性蛋白在越冬前大量積累，從而降低了細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度。然而，1月1日之后，外界氣溫快速下降，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和保護(hù)酶活性開始降低，致使枝條的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量開始迅速上升。在整個(gè)越冬期，3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、3種保護(hù)酶之間通過相互協(xié)調(diào)配合，保持了細(xì)胞的滲透平衡，并通過調(diào)整各自的含量和活性的變化來適應(yīng)低溫變化，從而保護(hù)香梨枝條安全越冬。

3.2　越冬期庫(kù)爾勒香梨不同月份枝條抵御凍害能力的綜合評(píng)價(jià)

隸屬函數(shù)法在植物抗寒性評(píng)價(jià)中是較為常用的一種綜合評(píng)價(jià)方法[19-20]，可以在多個(gè)指標(biāo)測(cè)定的基礎(chǔ)上，對(duì)植物的抗寒性進(jìn)行較為綜合和全面的評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)的結(jié)果較為科學(xué)、可靠。因此，本研究通過分析越冬期香梨枝條中抗寒性相關(guān)生理指標(biāo)的變化，利用隸屬函數(shù)法對(duì)不同月份香梨枝條抵御凍害的能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明：香梨枝條抵御凍害的能力在自然越冬過程中出現(xiàn)了動(dòng)態(tài)的變化，在全年氣溫最低的2 月，香梨枝條各生理指標(biāo)的平均隸屬度最小，此時(shí)香梨枝條抵御凍害的能力最弱，這與撒俊逸等[6]分析的2014—2015年越冬期香梨枝條抵御凍害的能力結(jié)論一致。

綜上，在自然越冬期間，氣溫降低導(dǎo)致的細(xì)胞膜破壞是香梨枝條受傷的重要原因之一，而可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及SOD、POD、CAT活性的動(dòng)態(tài)變化在一定程度上可以降低細(xì)胞膜系統(tǒng)的受損程度。運(yùn)用隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)香梨不同月份枝條抵御凍害的能力，結(jié)果顯示，在整個(gè)越冬過程中，全年氣溫最低的2月香梨枝條抵御凍害的能力最弱，因此，應(yīng)重點(diǎn)在此期間積極采取防寒措施，防止降溫給香梨帶來凍害。