王治方 ，焦文強(qiáng) ，張青嫻 ，朱文豪 ，李海利 ，方劍玉 ，張立憲 ，郎利敏 ，許 峰 ，婁治國(guó) ，王克領(lǐng) ，徐引弟

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002）

2017年6月，河南豫北某規(guī)模化豬場(chǎng)斷奶仔豬突然發(fā)生高燒、精神沉郁、食欲減退或不食，咳嗽喘氣、呼吸困難，四肢無力的傳染性病例，發(fā)病率為20%，死亡率為80%，病程為10 d左右。該疫情通過臨床癥狀和病理變化情況，初步懷疑為病毒和細(xì)菌混合感染引起的呼吸道綜合征。

規(guī)?；i場(chǎng)常見的細(xì)菌性疾病主要有副豬嗜血桿菌病、豬鏈球菌病、豬傳染性胸膜肺炎、豬大腸桿菌病等[1]；常見的病毒性疾病主要有豬偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥、豬圓環(huán)病毒病等。在生產(chǎn)實(shí)際中，單一病原感染較為少見，常常是2種或2種以上病原混合感染，為疾病的診斷和防控帶來很大困難[2-4]。

本研究通過對(duì)規(guī)?；i場(chǎng)斷奶仔豬的突發(fā)疫病開展臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室病原分離鑒定及動(dòng)物試驗(yàn)，從而確定了本次發(fā)病是由3種細(xì)菌混合感染所致；同時(shí)進(jìn)行了藥物敏感試驗(yàn)，并且采取針對(duì)性用藥的措施，及時(shí)控制了病情，旨在為規(guī)?；i場(chǎng)應(yīng)對(duì)突發(fā)性疫病采取快速有效的防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源 無菌采集2頭瀕死期病豬的肺臟、淋巴結(jié)、脾臟等病料組織保存，待實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

1.1.2 試劑 TSA，TSB（美國(guó)），購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；新生牛血清，購(gòu)自鄭州益康生物工程有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（輔酶I，NAD），購(gòu)自Roche公司；抗生素藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；微生物微量生化鑒定管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；微生物DNA提取試劑盒、DNA Marker DL2000、膠回收試劑盒、Lording buffer等均購(gòu)自寶生物（大連）工程有限公司。副豬嗜血桿菌引物、多殺性巴氏桿菌引物和化膿隱秘桿菌引物均為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所設(shè)計(jì)合成。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 20 g左右的小白鼠10只，購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原的分離、純化 將先前無菌采集的肺臟、氣管、肝臟分別接種于TSA平板（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD），放置于5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24～48 h，挑選可疑菌落純化、染色鏡檢。

1.2.2 生化鑒定 挑選純化好的單個(gè)菌落分別接種于TSB（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD）液體培養(yǎng)基中，放置于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24～48 h，分別取15 μL接種于不同的微生物鑒定微量生化管中，放置于CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24～48 h，觀察比對(duì)記錄生化結(jié)果，參照微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。

1.2.3 可疑菌PCR擴(kuò)增檢測(cè) 取上述TSB液體培養(yǎng)物1 mL于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清收集菌體沉淀；用微生物DNA提取試劑盒提取菌體DNA，進(jìn)行可疑菌PCR擴(kuò)增鑒定。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液13 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O5 μL，模板 5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

電泳：取10 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測(cè)，比照DNA Marker DL2000確定條帶大小。

測(cè)序：分別將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（武漢）股份有限公司純化、測(cè)序，每個(gè)測(cè)序結(jié)果分別進(jìn)行BLAST比較。

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法（K-B法），判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2005版[5-6]。分別挑取已純化過的TSA平板上若干單個(gè)菌落，置于0.9%滅菌生理鹽水中，制成均勻懸液，濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬ū壬珒x比色），取200 μL用滅菌棉拭子均勻涂抹于TSA平板（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD）上，每種可疑菌涂抹4個(gè)平板。挑取臨床上常有的抗生素藥敏片，用滅菌鑷子把藥敏片均勻貼在涂有菌液的平板上，于37℃培養(yǎng)24～48 h，取出觀察記錄藥敏片抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床診斷及病理變化

送檢2頭瀕死期病豬精神沉郁，高燒（體溫41℃），被毛粗亂，咳嗽氣喘，腹式呼吸，四肢無力，不愿站立。剖檢病豬可見全身淋巴結(jié)腫大、多汁；氣管充滿大量泡沫黏液；肺臟出血、發(fā)生不同程度的實(shí)變，有少量的纖維性蛋白滲出，病程稍長(zhǎng)的那頭病豬肺臟可見大小不一數(shù)量不等的化膿灶（圖1，2）；心肌偏軟，脾臟稍腫大，其他臟器未見明顯病變。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)、鏡檢、純化

從2頭病死豬氣管、肺臟接種的TSA平板上均長(zhǎng)出多種菌落，共挑選出3種可疑菌落。在培養(yǎng)24 h后，接種氣管、肺臟的TSA平板上均長(zhǎng)出一種圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、不透明、帶有熒光的露滴樣優(yōu)勢(shì)菌落；挑取單個(gè)菌落染色鏡檢為革蘭氏陰性，單個(gè)存在，偶見成雙存在的球桿菌；挑取單個(gè)菌落接種TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD）37℃培養(yǎng)24 h生長(zhǎng)良好，暫定為A（圖3）。培養(yǎng)24～36 h，接種氣管、肺臟的TSA平板上長(zhǎng)出一種光滑、濕潤(rùn)、略帶灰白色的針尖大小菌落；挑取單個(gè)菌落染色鏡檢為革蘭氏陽性，多形態(tài)的細(xì)小桿菌，大多單個(gè)存在；挑取單個(gè)菌落接種TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD）37℃培養(yǎng)24 h，菌落形態(tài)太小不明顯，36 h后菌落形態(tài)趨于正常，暫定為B（圖4）。培養(yǎng)36～48 h后，在接種肺臟的TSA平板上又長(zhǎng)出一種光滑、濕潤(rùn)、透明，帶有淡藍(lán)色熒光的小菌落，挑取單個(gè)菌落染色鏡檢為革蘭氏陰性，大多呈長(zhǎng)絲狀，少量細(xì)小桿菌存在；挑取單個(gè)菌落分別接種TSA平板（含5%的新生牛血清，含1/100 000 NAD）和TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD），37℃培養(yǎng)48 h后，接種TSA平板（含5%的新生牛血清，不含NAD）的未見細(xì)菌生長(zhǎng)；接種TSA平板（含5%的新生牛血清，含1/100 000 NAD）有均一的光滑、濕潤(rùn)、透明的小菌落生長(zhǎng)，暫定為C（圖5）。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)3種細(xì)菌分別進(jìn)行生化特性鑒定，每個(gè)生化反應(yīng)依據(jù)試劑盒說明書的判定標(biāo)準(zhǔn)判斷陰性、陽性，綜合多個(gè)生化反應(yīng)結(jié)果（表1），可疑菌A初步判定為多殺性巴氏桿菌；可疑菌B初步判定為化膿隱秘桿菌；可疑菌C初步判定為副豬嗜血桿菌。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 PCR擴(kuò)增、測(cè)序鑒定結(jié)果

對(duì)3株分離菌株的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳顯示，分別在457，1 358，821 bp處擴(kuò)增出3條特異性條帶，分別與多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、副豬嗜血桿菌的目的條帶大小相符。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BLAST序列比對(duì)，結(jié)果顯示，3種分離細(xì)菌的16S rRNA序列分別與多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、副豬嗜血桿菌同源性達(dá)97%，表明3種細(xì)菌分別為多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、副豬嗜血桿菌。3種細(xì)菌16SrRNA的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖6所示。

2.5 病毒性疾病的檢測(cè)

通過對(duì)可疑病料進(jìn)行豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒擴(kuò)增檢測(cè)，4種病毒病均為陰性，排除了病毒感染的可能性。

2.6 動(dòng)物試驗(yàn)

3種分離菌株的24 h培養(yǎng)物分別通過腹腔接種小白鼠 2只，1 mL/只（2×107cfu/mL）；滅菌生理鹽水腹腔接種小白鼠4只，1 mL/只。分籠單獨(dú)飼喂。接種后18～20 h，多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌接種的小白鼠精神萎靡，活動(dòng)減緩，有發(fā)病跡象。接種后24 h，化膿隱秘桿菌接種的小白鼠萎靡、遲鈍、發(fā)病。28 h多殺性巴氏桿菌接種的小白鼠死亡；36 h副豬嗜血桿菌接種的小白鼠死亡；40 h化膿隱秘桿菌接種的小白鼠死亡1只，另一只嚴(yán)重沉郁。小白鼠死亡后，立即解剖心血、肝臟觸片，革蘭氏染色鏡檢，均發(fā)現(xiàn)相對(duì)應(yīng)接種菌株。同時(shí)無菌采集死亡小白鼠的心血、肺臟、肝臟接種TSA平板（含5%的新生牛血清，1/100 000的NAD），均獲得相對(duì)應(yīng)的單一細(xì)菌。

根據(jù)臨床癥狀、病理變化、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果等情況，綜合判斷該場(chǎng)本次疫情是有副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌和化膿隱秘桿菌混合感染所致。

2.7 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

挑選6類19種抗生素對(duì)3種細(xì)菌分別作了藥物敏感性試驗(yàn)（表2）。通過藥敏試驗(yàn)可以看出，19種常用抗生素中只有頭孢噻肟、頭孢拉定、亞胺培南、左氟沙星、恩諾沙星、壯觀霉素對(duì)這3種細(xì)菌同時(shí)高度敏感。

表2 3種細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 治療、控制

根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，豬場(chǎng)全群飼料添加左氟沙星300 g/t，阿莫西林300 g/t，連用5 d；對(duì)發(fā)病不食或食欲下降豬只，肌肉注射藥物（壯觀霉素+氨基比林+維生素C），每天2次，連用3～5 d。飲水中添加電解多維，自由飲用，同時(shí)加強(qiáng)豬舍環(huán)境消毒，1次/d，降低豬群密度，加強(qiáng)豬舍通風(fēng)換氣，減少豬群應(yīng)激。

通過采取以上控制措施，除第2天死亡3頭外，發(fā)病豬于第3天好轉(zhuǎn)，全群未出現(xiàn)新的病例，5 d后豬群基本恢復(fù)正常。

4 結(jié)論與討論

本次疫情從疑似病例中同時(shí)分離出副豬嗜血桿菌、多殺性巴氏桿菌和化膿隱秘桿菌3種病原菌，而病毒性疾病為陰性，臨床上較為少見。

本次分離到的3種細(xì)菌均屬于條件致病菌，副豬嗜血桿菌為革蘭氏陰性多形態(tài)、細(xì)小桿菌，常寄生于豬的上呼吸道，臨床上常引起豬的以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎為特征的疾病，呈世界性分布[7-8]，臨床上常引起斷奶保育仔豬較高的發(fā)病率和死亡率，是當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)主要致病菌之一。多殺性巴氏桿菌為革蘭氏陰性球桿菌，常存在于健康動(dòng)物的呼吸道和消化道黏膜，是人畜共患的致病菌[9]。各種年齡的豬只都可感染，是引起豬呼吸道綜合征的常見病菌，世界各地均有流行?；撾[秘桿菌為革蘭氏陽性多形性桿菌，常寄生于豬、牛、羊的黏膜上，可感染人。臨床上常引起局部化膿性感染，臨床表現(xiàn)以肺炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎為主[10]，為條件致病菌，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中也是較罕見的致病菌之一。

在生產(chǎn)實(shí)際中，細(xì)菌性疾病極易和病毒如PRRSV，PRV和PCV2混合感染，或繼發(fā)于病毒感染之后，造成預(yù)防和治療困難[11]。該規(guī)?；i場(chǎng)病毒性疾病的免疫預(yù)防做的比較到位，因此，沒有發(fā)生病毒性疾病。綜合分析本次發(fā)病主要與豬場(chǎng)豬群密度過大、圈舍環(huán)境衛(wèi)生差、空氣不良應(yīng)激大有很大關(guān)系。

該豬場(chǎng)長(zhǎng)期使用磺胺類藥物、大環(huán)內(nèi)酯類藥物和四環(huán)素類藥物，預(yù)防弓形體、衣原體和呼吸道疾病，該豬場(chǎng)細(xì)菌已對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類和磺胺類藥物產(chǎn)生了一定的耐藥現(xiàn)象，對(duì)喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感性高。生產(chǎn)實(shí)際中，豬場(chǎng)獸醫(yī)工作人員一定要摒棄臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥的不良習(xí)慣，借助藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)生產(chǎn)科學(xué)合理用藥，減少或延緩細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。