任嘉興，張錦華，白寶清，范三紅

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

羊肚菌是一種珍貴的野生菌[1]。菌類的生物活性已經(jīng)被大多數(shù)人熟知。據(jù)報道，菌類多糖具有抗癌活性[2]、降血脂[3]、抗輻射[4]等功效。

賈建會等[5]研究結(jié)果表明，羊肚菌多糖在提高免疫力方面具有良好的功效。胡彥營等[6]試驗結(jié)果表明，羊肚菌多糖具有一定的抗疲勞功能。段巍鶴等[7]利用羊肚菌菌絲體胞內(nèi)多糖灌胃小鼠，結(jié)果表明，羊肚菌胞內(nèi)多糖具有應(yīng)急性抗疲勞保健作用。楊芳等[8]研究結(jié)果表明，羊肚菌多糖具有較好的抗氧化性。

現(xiàn)有的多糖提取方法表明，多糖在酸性條件下結(jié)構(gòu)被破壞，得率較低；而堿提法雖然得率較高，但提取過程復(fù)雜[9]。本試驗利用響應(yīng)面法，優(yōu)化羊肚菌多糖提取工藝，并進行體外抗氧化試驗，以期為羊肚菌進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

羊肚菌子實體購買于山西省安澤縣。

1.2 試劑及儀器設(shè)備

DPPH購自美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

AL204型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；HRHS24電熱恒溫水浴鍋，青島海爾醫(yī)用低溫科技有限公司；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SP-2000UV型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；SC-3614低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊肚菌多糖提取流程工藝 將羊肚菌在40℃條件下烘4 h，粉碎過0.2 mm孔徑篩。稱取3.00 g羊肚菌粉末置于錐形瓶，恒溫水浴，4 500 r/min離心15 min，上清液濃縮，加入4倍體積無水乙醇，4℃冰箱中醇沉12 h，離心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.2 單因素試驗 固定提取時間3 h、提取溫度85 ℃，測定不同液料比（30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1（mL/g）下羊肚菌多糖的得率；固定液料比40∶1（mL/g）、提取溫度 85℃，測定不同提取溫度（55，65，75，85，95 ℃）下羊肚菌多糖的得率；固定液料比 40∶1（mL/g）、提取時間 3 h，測定不同提取時間（1，2，3，4 h）下羊肚菌多糖的得率。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計響應(yīng)面試驗并進行分析。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 羊肚菌多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法[10]測定多糖含量，以吸光度值A(chǔ)為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C（mg/mL）為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程。

1.4.2 多糖得率計算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式（2）求得多糖得率。

式中，W1為樣品質(zhì)量；W2為W1提取的粗多糖質(zhì)量；W3為從W2中稱取的用于測定的粗多糖；V為定容W3的體積；C為多糖的質(zhì)量濃度。

1.4.3 羊肚菌多糖對DPPH自由基清除能力的測定 按照文獻[11]的方法，向試管中加入2 mL不同濃度的多糖溶液、2mLDPPH溶液，避光放置30min，517 nm波長處測定吸光度值。本底用無水乙醇代替DPPH測定吸光度值；對照組用蒸餾水代替樣品液。以Vc為陽性對照，按式（2）計算清除率。

式中，A1為不同濃度多糖溶液吸光度；A2為樣品本底吸光度；A0為對照溶液吸光度。

1.4.4 羊肚菌多糖對羥自由基（·OH）清除率的測定 在試管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、不同濃度多糖溶液1 mL以及30%的H2O2溶液1.0 mL，靜置30 min，510 nm波長處測定吸光度值。本底用蒸餾水代替H2O2。對照組用蒸餾水代替樣品，以Vc為陽性對照[12]，按式（3）計算樣品對·OH的清除率。

式中，A3為不同濃度多糖溶液吸光度；A4為樣品本底吸光度；A0'為對照溶液吸光度。

1.4.5 羊肚菌多糖還原力測定 取不同濃度多糖溶液1.0 mL于試管中，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液、2.0 mL的K3（Fe（CN）6），50℃水浴30 min，冷卻，加入2.0mL三氯乙酸。吸取反應(yīng)液2.0mL，加入2.0mL蒸餾水、0.4 mL FeCl3溶液，混勻，暗室反應(yīng)30 min，700 nm處測定吸光度。以Vc為陽性對照[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊肚菌多糖提取單因素試驗

2.1.1 液料比對多糖得率的影響 由圖1可知，當(dāng)液料比為40∶1（mL/g）時，多糖得率最高；再增加液料比，多糖得率降低?？赡苁怯捎谠黾尤軇┙嵛锱c溶劑接觸面積增大，多糖溶出較多，繼續(xù)增加溶劑用量使多糖的溶出達到飽和[14]。從實際試驗條件出發(fā)，提取液料比以40∶1（mL/g）為宜。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響 由圖2可知，溫度低于85℃，隨溫度升高，多糖得率增加；85℃時，多糖得率達到最高，為2.65%；溫度高于85℃時，多糖得率降低?？赡苁怯捎诙嗵堑奶擒真I被高溫破壞，得率降低[15]。因此，提取溫度應(yīng)以85℃為宜。

2.1.3 提取時間對多糖得率的影響 由圖3可知，提取時間低于3 h時，多糖得率上升；提取時間高于3 h時，隨提取時間的增加，多糖得率逐漸下降?？赡苁且驗樘崛r間短，多糖與提取液反應(yīng)不充分；提取時間過長，多糖分解，得率降低。因此，提取時間3 h為宜。

2.2 響應(yīng)面分析法對羊肚菌多糖提取工藝的優(yōu)化

表1 響應(yīng)面試驗水平

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對影響羊肚菌多糖得率的3個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，結(jié)果列于表1，2。

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析及回歸方程 根據(jù)表2試驗結(jié)果，利用DesignExpert 8.0.6軟件進行分析，得到回歸方程為：Y＝-107.06338+0.31568A＋2.11058B＋7.94225C＋0.00675AB－0.010750AC＋0.02525BC－0.010710A2－0.014060B2－1.54850C2。

表3 回歸方程方差分析結(jié)果

從表3可以看出，回歸模型P＜0.01，極顯著；失擬項P＞0.05，不顯著。說明該回歸方程擬合效果好。模型中一次項 B、二次項 A2，B2，C2，交互項 AB影響極顯著；一次項C影響顯著。對多糖得率的影響從大到小為B＞C＞A。該回歸方程對提取羊肚菌多糖提供了一個合適的模型。

2.2.2 各因素交互作用對多糖得率的響應(yīng)面分析響應(yīng)面分析法通過確定的試驗對試驗因素進行分析。從圖4可以看出，提取溫度與液料比交互作用極顯著，液料比在（35∶1）～（45∶1），提取溫度在80～90℃，提取時間在2.5～3.5 h時，羊肚菌多糖得率達到最大值。液料比、提取時間的增加，提取溫度的升高，都不利于多糖的提取。

2.2.3 最優(yōu)工藝參數(shù)的確定 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得出，羊肚菌多糖提取最佳條件為液料比40.78∶1（mL/g）、提取溫度87.67℃、提取時間3.14 h，在此條件下預(yù)測多糖得率為4.35%。綜合考慮，將提取條件修正為液料比41∶1（mL/g）、提取溫度88℃、提取時間3 h，在此條件下重復(fù)3次，多糖得率穩(wěn)定在4.24%±0.17%，與預(yù)測值基本一致，模型可靠，具有實際應(yīng)用價值。

2.3 羊肚菌多糖體外抗氧化測定

2.3.1 羊肚菌多糖對DPPH自由基的清除作用活性成分與DPPH的電子結(jié)合，517 nm處DPPH吸收減弱，由此可以評價物質(zhì)對自由基的清除能力[18]。從圖5可以看出，多糖質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增加到1 mg/mL，DPPH自由基清除率從10.41%增加到52.21%，多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，清除能力是對照Vc的55.37%，表明羊肚菌多糖能較好地清除DPPH自由基。

2.3.2 羊肚菌多糖對·OH的清除作用 利用在體系中加入清除·OH的物質(zhì)與水楊酸競爭吸收·OH從而降低吸光度的原理評價物質(zhì)清除·OH的能力[19]。從圖6可以看出，多糖質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增加到1.0 mg/mL，·OH自由基清除率從39.29%增加到79.77%，濃度為1 mg/mL多糖質(zhì)量的清除能力是對照Vc的79.83%，表明羊肚菌多糖清除·OH自由基能力較強。

2.3.3 羊肚菌多糖的還原能力 從圖7可以看出，Vc的還原能力先快速增加，隨后保持不變；羊肚菌多糖的還原能力變化不大，且弱于Vc。由此可知，羊肚菌多糖具有一定的還原能力。

3 結(jié)論

本試驗以羊肚菌子實體為原料，水提醇沉法提取多糖，結(jié)果確定最優(yōu)提取條件為：液料比41∶1（mL/g）、提取溫度88℃、提取時間3 h，在此優(yōu)化條件下，羊肚菌多糖的得率穩(wěn)定為4.24%±0.15%；羊肚菌多糖對DPPH和·OH自由基有明顯的清除作用，并與其濃度呈正相關(guān)，且具有一定的還原能力，這為羊肚菌進一步研究提供了理論依據(jù)。