監(jiān)測核苷（酸）類抗HBV藥物治療CHB的停藥指標(biāo)

劉璐潔，劉　妍，劉新光，徐東平

HBV持續(xù)復(fù)制是促進(jìn)慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）進(jìn)展的關(guān)鍵因素，核苷（酸）類似物（nucleoside/nucleotide analogues, NUCs）是當(dāng)前臨床最常用的抗病毒治療藥物，其主要通過抑制病毒的反轉(zhuǎn)錄和DNA合成發(fā)揮抗病毒作用。積極的抗病毒治療能夠明顯延緩肝病進(jìn)程，減少終末期肝病的發(fā)生，但由于NUCs不能完全清除肝組織內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA, cccDNA），一旦停藥往往會(huì)發(fā)生病毒學(xué)反彈和疾病復(fù)發(fā)。因此，我國2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》[1]推薦長期抗病毒治療。長期甚至終生服藥往往使患者難以接受，影響依從性；巨額的藥費(fèi)又給患者家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，故有必要篩選并明確輔助評價(jià)抗HBV治療CHB患者停藥的新指標(biāo)，提高成本效益的可行性。本文就近年來新的指導(dǎo)CHB患者停藥的指標(biāo)，如肝組織HBV cccDNA、血清HBcrAg和血清HBV RNA等的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　監(jiān)測NUCs治療CHB患者停藥的傳統(tǒng)指標(biāo)

目前，CHB患者診療評價(jià)的血清學(xué)標(biāo)志物主要有HBsAg/抗 -HBs、HBeAg/抗 -HBe和抗-HBc等。其中抗-HBc主要是IgG型抗體，只要感染過HBV，無論病毒是否被清除，此抗體多為陽性。Hou等[2]在2015年的研究中提示，在接受聚乙二醇干擾素（pegylated interferons,Peg-IFN）治療的HBeAg陽性CHB患者中，基線抗-HBc定量≥30 000 IU/ml的患者具有更高的病毒學(xué)應(yīng)答率、HBV DNA抑制率和肝炎復(fù)常率，提示基線抗-HBc水平可以預(yù)測Peg-IFN療效。2016年Fan等[3]進(jìn)一步的研究顯示，在接受Peg-IFN和NUCs治療的2組HBeAg陽性CHB患者中，基線抗-HBc定量≥4.4 log10IU/ml（相當(dāng)于30 000 IU/ml）及基線HBV DNA ＜9 log10copies/ml的患者具有更高的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化率，2組分別為65.8%和37.1%，其中基線抗-HBc水平是HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化率的最佳獨(dú)立預(yù)測因子，在優(yōu)化抗病毒治療中具有實(shí)用價(jià)值。

指南提出CHB患者治療的理想終點(diǎn)是HBeAg陽性和HBeAg陰性的患者停藥之后實(shí)現(xiàn)持久的HBsAg清除，伴或不伴HBsAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換[1]。CHB患者治療的滿意終點(diǎn)是HBeAg 陽性患者停藥后獲得持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答，ALT復(fù)常，并伴有HBeAg 血清學(xué)轉(zhuǎn)換；HBeAg 陰性患者停藥后獲得持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答和ALT 復(fù)常。CHB治療的基本終點(diǎn)是如果停藥后無法獲得持續(xù)應(yīng)答，至少在抗病毒治療期間能夠長期維持病毒學(xué)應(yīng)答。目前臨床上判斷CHB患者是否可以停藥的指標(biāo)主要是持久的HBsAg清除以及停藥后獲得持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答。

血清HBsAg由肝內(nèi)HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄而來，其水平與肝內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)，清除血清HBsAg可以顯著降低CHB患者發(fā)生肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[4]。但是，即使應(yīng)用目前認(rèn)為HBsAg陰轉(zhuǎn)率最高的Peg-IFN治療后，HBsAg陰轉(zhuǎn)率仍然很低；而NUCs治療后HBsAg陰轉(zhuǎn)率更低[5]。因此，提高血清HBsAg的陰轉(zhuǎn)率對CHB患者的治療有重要意義。目前許多學(xué)者致力于血清HBsAg清除的相關(guān)研究。Cornberg等[6]研究指出，在NUCs治療過程中，血清HBsAg快速下降至低水平與血清HBsAg的清除相關(guān)。Peng等[7]研究指出基線水平血清HBsAg＜3000 IU/ml且HBeAg陽性患者最初治療3個(gè)月和HBeAg陰性患者最初治療12個(gè)月時(shí)血清HBsAg下降≥基線的75%可以預(yù)測血清HBsAg陰轉(zhuǎn)。另外，血清HBsAg的基線水平和抗病毒治療結(jié)束時(shí)的水平可以預(yù)測HBV的復(fù)發(fā)[8]。

雖然血清HBsAg主要來自感染肝細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA，但越來越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，整合的HBV DNA片段也能轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生HBsAg[9]。而最近的研究報(bào)道顯示，CHB患者肝細(xì)胞存在大量的整合HBV DNA片段，最高可有1%肝細(xì)胞帶有整合的病毒DNA片段，即患者最多可有上億肝細(xì)胞帶有整合病毒片段[10]。整合的病毒DNA片段的斷點(diǎn)多集中在病毒基因組DR1和DR2區(qū)域，而病毒的S基因區(qū)域多保持完整，具有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生HBsAg的潛能[11]。因此，血清中的HBsAg也可能來源于整合的HBV DNA片段。這可能是臨床上部分患者血清HBsAg難以清除的原因之一。

2　監(jiān)測NUCs治療CHB患者停藥的新指標(biāo)

2.1 肝組織HBV cccDNA

2.1.1 肝組織HBV cccDNA的定義 當(dāng)HBV病毒顆粒（Dane顆粒）侵入肝細(xì)胞后，首先脫去包膜形成核衣殼，然后脫去衣殼，裸露出松弛環(huán)狀雙鏈DNA（relaxed circular DNA, rcDNA），進(jìn)入肝細(xì)胞核內(nèi)，在宿主酶的作用下，形成cccDNA；再以cccDNA為模板，轉(zhuǎn)錄成前基因組RNA（pregenome RNA, pgRNA）和幾種不同長度的mRNA。pgRNA在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，形成子代rcDNA，并在肝細(xì)胞質(zhì)中裝配形成完整的HBV，釋放出肝細(xì)胞，進(jìn)入血液；肝細(xì)胞質(zhì)中的rcDNA也可再進(jìn)入肝細(xì)胞核，再次形成cccDNA，繼續(xù)同樣的復(fù)制過程（見圖1）。cccDNA在HBV感染初期可被檢測到，且長期存在于細(xì)胞核中形成cccDNA池，對HBV的復(fù)制以及感染狀態(tài)的建立具有十分重要意義，它的長期存在是乙型肝炎慢性化的主要原因之一[12]。

圖1 肝組織HBV cccDNA、血清HBV RNA和血清HBcrAg形成過程示意圖Figure 1 Schematic diagram of the production of intrahepatic HBV cccDNA, serum HBV RNA and serum HBcrAg

2.1.2 肝組織HBV cccDNA的研究進(jìn)展 肝組織HBV cccDNA的徹底清除是目前公認(rèn)的CHB患者“治愈”的指征。由于現(xiàn)有的抗病毒治療藥物對cccDNA無法直接清除，停藥后往往發(fā)生高比例的病毒學(xué)反彈和疾病復(fù)發(fā)[13]。Wong等[14]發(fā)現(xiàn)CHB患者經(jīng)過短期（24個(gè)月）NUCs治療后，可以明顯降低血清HBV DNA含量，血清HBsAg和肝組織HBV cccDNA水平也有下降但下降不明顯。該研究團(tuán)隊(duì)繼續(xù)隨訪研究發(fā)現(xiàn)，隨著NUCs藥物治療時(shí)間的延長（126個(gè)月），可顯著降低肝組織HBV cccDNA含量，且該研究中有21例患者肝組織HBV cccDNA水平低于檢測下限[15]；另外，血清HBsAg水平也逐漸下降，但減少的程度遠(yuǎn)沒有肝組織cccDNA下降的多。以上研究表明，經(jīng)過長期抗病毒治療，可能清除肝組織HBV cccDNA。同時(shí)，也表明CHB患者經(jīng)過長期NUCs治療后，肝組織cccDNA與血清HBsAg水平不相關(guān)（P=0.209）。

近年來，關(guān)于肝組織HBV cccDNA與血清HBV DNA的相關(guān)性存在不同的研究結(jié)果[16-17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)肝組織HBV cccDNA與血清HBV DNA的相關(guān)性受HBV感染時(shí)期的影響，其中免疫清除期和HBeAg陰性肝炎期的患者肝組織HBV cccDNA與血清HBV DNA水平相關(guān)。

總之，血清HBsAg和血清HBV DNA水平并不能完全代表肝組織HBV cccDNA水平，即使血清HBsAg和血清HBV DNA轉(zhuǎn)陰，肝組織內(nèi)仍然可以檢測到HBV cccDNA[19]。因此，直接檢測肝組織內(nèi)HBV cccDNA有助于真正了解病毒復(fù)制情況，只有清除了細(xì)胞核內(nèi)的HBV cccDNA，才能徹底消除病毒攜帶狀態(tài)。肝組織內(nèi)HBV cccDNA檢測可視為目前診斷CHB患者病情和判斷療效最有潛力和價(jià)值的指標(biāo)，對評價(jià)藥物治療HBV的療效，幫助了解機(jī)體清除HBV的程度，為臨床醫(yī)生判斷停止抗病毒治療的時(shí)間及停止治療后HBV是否會(huì)重新復(fù)制導(dǎo)致乙型肝炎復(fù)發(fā)有重要意義[12]。

2.1.3 肝組織HBV cccDNA的應(yīng)用局限性 由于檢測肝組織HBV cccDNA的含量須行肝組織活檢，因此在臨床工作中較難開展。本課題組與解放軍第三○二醫(yī)院病理診斷與研究中心合作，創(chuàng)建了CHB患者微量石蠟包埋肝組織HBV cccDNA定量檢測方法，該方法具有較好的特異度、靈敏度和穩(wěn)定性。另外，該方法可利用臨床常規(guī)組織病理檢測后剩余的肝組織進(jìn)行檢測，在一定程度上克服了檢測樣本來源受限的困難，同時(shí)有利于留存組織的回顧性研究[20]。

2.2 血清HBcrAg

2.2.1 血清HBcrAg的定義 HBcrAg是由前C/C區(qū)編碼的一系列蛋白，主要包括HBcAg、HBeAg和p22crAg。其中HBcAg存在于HBV顆粒的核心，是HBV的結(jié)構(gòu)蛋白即病毒核殼蛋白；HBeAg是存在于血清中的可溶性肽，一般情況下，HBeAg埋藏于HBcAg內(nèi)部，當(dāng)HBcAg裂解時(shí)，HBeAg從肝細(xì)胞核內(nèi)釋放入血清[21]；p22crAg存在于HBV DNA陰性的空Dane顆粒中，是包含從-28～150氨基酸序列的一種前核心蛋白，包括未剪切的信號序列但缺少C末端的精氨酸富集區(qū)域[22]（見圖1）。

2.2.2 血清HBcrAg的研究進(jìn)展 Wong等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在自然感染狀態(tài)下血清HBcrAg與肝內(nèi)HBV cccDNA、肝內(nèi)總HBV DNA和血清HBV DNA高 度 相 關(guān)（r=0.70，P＜0.0001；r=0.67，P＜ 0.0001；r =0.69，P＜0.0001）。經(jīng)過長期NUCs抗病毒治療，血清HBcrAg下降的程度與肝組織cccDNA下降的程度具有可比性。同時(shí)，該研究者還發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者血清中HBV DNA陰性時(shí)，仍然可以檢測到HBcrAg，此時(shí)，血清HBcrAg水平與肝組織HBV cccDNA仍然有很好的相關(guān)性（r=0.42，P＜0.0001）。此結(jié)果表明血清HBcrAg是一個(gè)可靠的能替代肝組織HBV cccDNA的血清學(xué)標(biāo)志物，它可以很敏感地反映肝組織HBV cccDNA的含量以及病毒的持續(xù)狀態(tài)。Maasoumy等[24]在研究感染A或D基因型HBV的歐洲人群時(shí)發(fā)現(xiàn)血清HBcrAg水平與血清HBsAg水平相關(guān)。近期，有報(bào)道指出：與血清HBsAg相比，血清HBcrAg更能體現(xiàn)與肝內(nèi)HBV cccDNA的相關(guān)性[25]。以上均表明血清HBcrAg可能是一個(gè)令人滿意的肝內(nèi)HBV cccDNA替代標(biāo)志物，因此，在監(jiān)測NUCs治療CHB患者停藥方面具有很好的應(yīng)用前景。

近年來，許多研究都揭示了血清HBcrAg的臨床價(jià)值。Song等[26]討論了血清HBcrAg水平對HBeAg自發(fā)性血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測價(jià)值，提出血清HBcrAg水平的降低與HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換有關(guān)。同時(shí)，血清HBcrAg水平也是鑒別拉米夫定停藥后復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性的一個(gè)有用的標(biāo)志物，經(jīng)拉米夫定治療后，非復(fù)發(fā)患者血清HBcrAg水平顯著低于復(fù)發(fā)患者[27]。除此之外，血清HBcrAg還可用于評估肝癌發(fā)生與復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。Tada等[28]指出，沒有進(jìn)行NUCs抗病毒治療的CHB患者，血清HBcrAg＞2.9 log10IU/ml可以預(yù)測肝癌的發(fā)生。經(jīng)NUCs抗病毒治療的肝癌患者，血清HBcrAg水平具有預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)的作用，Hosaka等[29]指出血清HBcrAg＞4.8 log10IU/ml是診斷肝癌再發(fā)生的獨(dú)立因素。

2.2.3 血清HBcrAg應(yīng)用的局限性 目前，用于檢測血清HBcrAg的方法主要是化學(xué)發(fā)光酶免疫分析技術(shù)，這是一種同時(shí)檢測前C/C基因區(qū)編碼的HBcAg、HBeAg、p22crAg等3種蛋白抗原總體的技術(shù)[30]（見圖2）。但在檢測HBcrAg時(shí)，由于HBcAg和p22crAg分別存在于Dane顆粒和空的Dane顆粒中，所以在檢測前須先加開殼劑，使其釋放；并且對于抗-HBc或抗-HBe陽性的樣本，血清標(biāo)本須經(jīng)過預(yù)處理使HBeAg和HBcAg分別從患者自身的抗原-抗體復(fù)合物中釋放出來；最后，還須將抗原的立體結(jié)構(gòu)打開成直線狀[31]。檢測血清HBcrAg的前處理過程較復(fù)雜，是其難以在臨床上推廣的主要原因。

2.3 血清HBV RNA

圖2 血清HBcrAg的檢測原理Figure 2 Detecting principle of serum HBcrAg

2.3.1 血清HBV RNA的定義 早在1996年K?ck 等[32]就在感染HBV患者的血清中發(fā)現(xiàn)了HBV RNA。然而一直以來，因具有感染性的、完整的Dane顆粒所攜帶的病毒基因組為帶有缺口的rcDNA，人們一直認(rèn)為HBV為嗜肝DNA病毒屬的病毒，研究者對于自由存在于細(xì)胞外且在血液中循環(huán)的RNA的來源并不是很明確。近年來，有研究報(bào)道，在血清中檢測到的HBV RNA可能合并存在于HBV病毒顆粒中[33-34]。最近，Wang等[35]通過一系列實(shí)驗(yàn)證明了血清中的HBV RNA來源于感染肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA活性轉(zhuǎn)錄的3.5 kb的pgRNA，這些pgRNA未經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，由核衣殼和包膜包裹釋放入血液（見圖1）。

2.3.2 血清HBV RNA的研究進(jìn)展 近年來，有研究報(bào)道稱基線血清HBV RNA水平可以預(yù)測IFN或NUCs對CHB患者的抗病毒效果[33]，并且同時(shí)監(jiān)測血清HBV DNA和HBV RNA水平可預(yù)測NUCs治療后復(fù)發(fā)[36]。Wang等[35]通過小樣本回顧性臨床研究發(fā)現(xiàn)，停藥點(diǎn)血清HBV RNA未檢出的CHB患者發(fā)生停藥后病毒學(xué)反彈的風(fēng)險(xiǎn)明顯下降，并提出CHB患者血清HBV RNA水平可能反映肝內(nèi)HBV cccDNA水平。當(dāng)血清中檢測不到HBV RNA時(shí)，提示患者肝組織HBV cccDNA的消失或轉(zhuǎn)錄靜默，預(yù)示著可以安全停藥。最近Giersch等[37]初步驗(yàn)證了血清HBV RNA可以作為反應(yīng)肝內(nèi)HBV cccDNA活動(dòng)性的指標(biāo)。該研究利用HBV感染小鼠，分別使用NUCs和Peg-IFN對小鼠進(jìn)行抗病毒治療，測定治療前后血清HBV RNA、肝pgRNA及肝HBV cccDNA，結(jié)果表明：經(jīng)NUCs治療4周后的小鼠血清HBV DNA水平下降，血清HBV RNA水平輕微的上升；而用Peg-IFN治療后血清HBV DNA和HBV RNA水平均下降。在經(jīng)治及未經(jīng)治療的HBV感染小鼠中，血清HBV RNA水平與肝內(nèi)pgRNA水平均相關(guān)（r=0.82，P＜0.0001）；在未經(jīng)治療的HBV感染小鼠，血清HBV RNA水平與肝內(nèi)HBV cccDNA水平相關(guān)（r=0.89，P＜0.0001），表明血清pgRNA水平可以反應(yīng)肝內(nèi)HBV cccDNA的活動(dòng)性。由于該實(shí)驗(yàn)所用小鼠均為HBeAg陽性，所以對于血清HBeAg狀態(tài)是否影響血清HBV RNA與肝內(nèi)HBV cccDNA的相關(guān)性仍須進(jìn)一步研究。Wang等[38]研究表明血清HBeAg的狀態(tài)可能會(huì)對血清HBV RNA和肝內(nèi)HBV cccDNA的相關(guān)性有潛在的影響。該研究分別對未經(jīng)治療的HBeAg陽性或陰性患者血清HBV RNA與肝內(nèi)HBV cccDNA的相關(guān)性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，在HBeAg陽性患者中，血清HBV RNA與肝內(nèi)HBV cccDNA相關(guān)（r=0.39，P=0.002）；但對于HBeAg陰性患者，這種相關(guān)性并不存在（r=0.10，P=0.654）。同時(shí)還分析了接受NUCs治療患者的血清HBV RNA水平與肝內(nèi)HBV cccDNA的相關(guān)性，這與Giersch的研究結(jié)果相似。經(jīng)過治療后，血清HBV RNA水平與肝內(nèi)cccDNA水平?jīng)]有相關(guān)性。但是卡方檢驗(yàn)表明檢測血清HBV RNA水平可以反映肝內(nèi)HBV cccDNA的狀態(tài)及活性（P=0.001）。

為了使更多患者實(shí)現(xiàn)臨床治愈（血清HBsAg轉(zhuǎn)陰或血清學(xué)轉(zhuǎn)換）這一抗病毒治療的理想終點(diǎn)，有專家提出，可以通過對患者進(jìn)行血清HBsAg和HBV RNA精準(zhǔn)定量檢測，聯(lián)合使用血清HBsAg和HBV RNA對患者進(jìn)行監(jiān)測。將血清HBsAg＜1500 IU/ml的NUCs經(jīng)治CHB患者按血清HBV RNA檢測結(jié)果分為HBV RNA陽性患者（HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄及RNA病毒復(fù)制）和血清HBV RNA陰性患者（HBV cccDNA耗竭或轉(zhuǎn)錄靜默），對前者在繼續(xù)使用NUCs治療的前提下加用Peg-IFN；對后者則停用NUCs，改用Peg-IFN治療。這一基于血清HBV RNA檢測的以臨床治愈為目標(biāo)的治療方案有可能進(jìn)一步提高CHB患者臨床治愈率、降低社會(huì)成本[39]。

2.3.3 血清HBV RNA應(yīng)用的局限性 血清HBV RNA的概念剛剛提出，因此，對于血清HBV RNA水平與肝組織HBV cccDNA水平的相關(guān)性仍須進(jìn)一步確定。另外，檢測RNA時(shí)容易受到污染。因此，須要建立靈敏度高，精確度好的檢測方法。

3　小結(jié)與展望

目前CHB患者抗病毒治療藥物仍以NUCs為主，理想的治療終點(diǎn)和可能產(chǎn)生的耐藥性成為治療中不可回避的問題。因此，在治療中對患者的實(shí)時(shí)跟蹤就顯得尤為重要。傳統(tǒng)的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換以及HBV DNA檢測已經(jīng)不能滿足現(xiàn)在的需求，而且由于血清HBsAg不能完全代表肝細(xì)胞內(nèi)HBV復(fù)制情況且血清HBsAg陰轉(zhuǎn)不易達(dá)到，因此，迫切需要更好的能指導(dǎo)CHB患者治療的新指標(biāo)。雖然現(xiàn)在認(rèn)為肝組織HBV cccDNA、血清HBcrAg和血清HBV RNA都是具有潛力的監(jiān)控CHB患者安全停藥的指標(biāo)，但是仍然需要前瞻性的隊(duì)列研究證實(shí)；同時(shí)，若要應(yīng)用于臨床，還須要建立特異的、靈敏的、穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法。如果在以后的研究中能夠找到更為合理的一項(xiàng)或一組監(jiān)測CHB患者停藥的指標(biāo)，則對于減輕患者和社會(huì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。