沈　艷，何新明，林喜娜，陳貴東，楊　通，古婉儀，顧　霞

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 病理科，廣東 廣州　511447；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 病理科，廣東 廣州　510120)

彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)是淋巴瘤中最常見的一種類型，占所有非霍奇金淋巴瘤的30%～40%，中位發(fā)病年齡為60～70歲，在臨床表現(xiàn)、組織形態(tài)和預(yù)后等方面具有高度的異質(zhì)性。Hippo通路是一條在進(jìn)化上十分保守的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。Yes相關(guān)蛋白是Hippo通路的主要效應(yīng)分子，具有轉(zhuǎn)錄共激活因子活性，Yes相關(guān)蛋白表達(dá)異?？墒辜?xì)胞異常增殖導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。近年來Yes相關(guān)蛋白在實(shí)體腫瘤中的研究已成為熱點(diǎn)，但在淋巴瘤中的表達(dá)和作用尚不清楚，國內(nèi)尚未見相關(guān)研究報(bào)道。p63和BCL-2是凋亡調(diào)控的重要因子，與淋巴瘤的發(fā)病有關(guān)。本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)對45例DLBCL和25例反應(yīng)性增生淋巴組織(reactive hyperplasia of lymphoid tissue，RHL)中Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測，旨在探討其在DLBCL中表達(dá)的相互關(guān)系和臨床病理意義。

1　材料與方法

1.1研究對象收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2012～2017年經(jīng)病理檢查確診為DLBCL的存檔石蠟標(biāo)本45例，入選病例由兩名資深病理專家復(fù)讀切片，對其組織學(xué)類型進(jìn)行回顧性分析并確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016年WHO關(guān)于淋巴組織腫瘤分類[3]。其中，男27例，女18例，年齡20～89歲，平均年齡(63.9±14.3)歲；結(jié)內(nèi)31例，結(jié)外14例。按CD10、BCL-6和MUM1的表達(dá)將DLBCL分為生發(fā)中心B細(xì)胞型(germinal center B cell-like，GCB)和非生發(fā)中心B細(xì)胞型(non-germinal center B cell-like ，non-GCB)兩個(gè)亞型，其中GCB型9例，non-GCB36例。另選取25例RHL標(biāo)本作為對照組。

1.2方法

1.2.1主要試劑濃縮型Yes相關(guān)蛋白鼠抗人單克隆抗體 (克隆號：GT256，濃度為1.68 mg/mL，)購自美國GeneTex公司，工作濃度按1∶800進(jìn)行稀釋。即用型p63和Bcl-2鼠抗人單克隆抗體為Dako公司產(chǎn)品，免疫組化GTVisionTMI/HRP試劑盒購自基因科技有限公司。

1.2.2Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2蛋白檢測采用免疫組化GTVision二步法：石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5 min，加枸櫞酸，微波抗原修復(fù)，中火，3 min×3次；自然冷卻至室溫；PBS液沖洗3 min×3次；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，孵育10 min；PBS液沖洗3 min×3次；滴加一抗，室溫箱孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次；滴二抗(GTVisionTMI型聚合物)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次；DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。每批染色均設(shè)陽性對照和陰性對照。以已知陽性反應(yīng)片做陽性對照，以PBS替代一抗做陰性對照。

1.2.3結(jié)果判斷免疫組化染色陽性信號呈黃色或棕黃色顆粒。Yes相關(guān)蛋白主要定位于細(xì)胞漿，p63定位于細(xì)胞核，Bcl-2定位于細(xì)胞漿。Yes相關(guān)蛋白采用半定量方法判斷結(jié)果[4]：① 按細(xì)胞染色強(qiáng)弱評分：0分，不著色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色；② 根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比分為：0分，無陽性細(xì)胞； 1分，陽性細(xì)胞數(shù)<10%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)10%～50%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%。按①②乘積判斷結(jié)果：0為陰性，1～2為(+)，3～4為(++)，>4為(+++)。P63和Bcl-2按陽性百分比分級[5]：(-)，無陽性腫瘤細(xì)胞或陽性腫瘤細(xì)胞<30%；(+)，陽性腫瘤細(xì)胞≥30%。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理，組間率的比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05(雙尾值)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)分析用行×列表資料的關(guān)聯(lián)性檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)，以P<0.05(雙尾值)為二者相關(guān)，列聯(lián)系數(shù)以Cp表示。

2　結(jié)果

2.1Yes相關(guān)蛋白在DLBCL和RHL中的表達(dá)Yes相關(guān)蛋白在DLBCL中的表達(dá)陽性率為60.0%，陽性標(biāo)記細(xì)胞呈散在或彌漫分布；而在RHL中表達(dá)陽性率為100%，陽性標(biāo)記細(xì)胞在濾泡區(qū)和濾泡間區(qū)各階段淋巴細(xì)胞中呈彌漫分布，以濾泡生發(fā)中心表達(dá)強(qiáng)度最高。Yes相關(guān)蛋白在DLBCL和RHL之間表達(dá)差異有顯著性(P<0.05，見表1，圖1～3)。

表1Yes相關(guān)蛋白在DLBCL和RHL中的表達(dá)

組別例數(shù)Yes相關(guān)蛋白-++++++陽性率(%)PDLBCL4518191760.00.001RHL25001114100.0

呈彌漫陽性，SP×100。　　圖1　Yes相關(guān)蛋白在DLBCL中表達(dá)

圖2　Yes相關(guān)蛋白主要定位于細(xì)胞胞漿內(nèi)(SP×200)

呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞彌漫分布在濾泡區(qū)和濾泡間區(qū)，SP×50?！　D3　Yes相關(guān)蛋在RHL中表達(dá)

2.2p63、Bcl-2在DLBCL和RHL中的表達(dá)p63和Bcl-2在DLBCL中的表達(dá)陽性率分別為44.4%和82.2%，且陽性細(xì)胞呈彌漫分布。在RHL中，p63的表達(dá)陽性率為0，而Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞主要分布于套區(qū)和副皮質(zhì)區(qū)，濾泡生發(fā)中心為陰性，均為正常表達(dá)模式，未見異常表達(dá)。p63、Bcl-2蛋白在DLBCL和RHL兩組間表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2，圖4～6)。

2.3Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2表達(dá)與DLBCL臨床病理特征的關(guān)系Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2三指標(biāo)的表達(dá)與患者性別、年齡、病變部位和免疫表型等臨床病理參數(shù)均無相關(guān)性(P>0.05，見表3)。

表2p63、Bcl-2在DLBCL和RHL中的表達(dá)

組別例數(shù)p63陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)PBcl-2?陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)PDLBCL4525(55.6)20(44.4)0.0008(17.8)37(82.2)0.000RHL25 25(100.0)0(0.0)25(100.0)0(0.0)

*Bcl-2在RHL中呈正常表達(dá)模式判讀為陰性，呈異常表達(dá)模式判讀為陽性。

圖4　p63在DLBCL中表達(dá)呈彌漫陽性表達(dá)(SP×100)

呈正常表達(dá)模式，即陽性表達(dá)細(xì)胞主要分布于套區(qū)和副皮質(zhì)區(qū)，濾泡生發(fā)中心為陰性，SP×50?！　D5　Bcl-2在RHL中表達(dá)

呈彌漫強(qiáng)陽性異常表達(dá)，SP×200?！　D6　Bcl-2在DLBCL中表達(dá)

2.4Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2表達(dá)在DLBCL中的相關(guān)性在DLBCL組織中，p63在Yes相關(guān)蛋白陰性組和Yes相關(guān)蛋白陽性組中的表達(dá)陽性率分別為38.9%(7/18)和48.1%(13/27)，差異無顯著性(Cp=0.091，P>0.05)；Bcl-2在Yes相關(guān)蛋白陰性組和Yes相關(guān)蛋白陽性組中的表達(dá)陽性率分別為88.9%(16/18)和77.8%(21/27)，差異無顯著性(Cp=0.141，P>0.05)。Bcl-2在p63蛋白陰性組和p63蛋白陽性組中表達(dá)陽性率分別為80%(20/25)和85%(17/20)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Cp=0.166，P>0.05)；Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2三者表達(dá)之間無相關(guān)性(見表4～5)。

表3Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2表達(dá)與DLBCL各臨床病理特征的關(guān)系

病理特征例數(shù)Yes相關(guān)蛋白陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)PP63 陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)PBcl-2陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)P性別　男2710(37.0)17(63.0)0.61913(48.1)14(51.9)0.2213(11.1)24(88.9)0.301　女188(44.4)10(55.6)12(66.7)6(33.3)5(27.8)13(72.2)年齡　<60歲197(36.8)12(63.2)0.71210(52.6)9(47.4)0.7362(10.5)17(89.5)0.488　≥60歲2611(42.3)15(57.7)15(57.7)11(42.3)6(23.1)20(76.9)病變部位　結(jié)內(nèi)3114(45.2)17(54.8)0.29316(51.6)15(48.4)0.4284(12.9)27(87.1)0.394　結(jié)外144(28.6)10(71.4)9(64.3)5(35.7)4(28.6)10(71.4)免疫分型　GCB93(33.3)6(66.7)0.9397(77.8)2(22.2)0.2611(11.1)8(88.9)0.922　non-GCB3615(41.7)21(58.3)18(50.0)18(50.0)7(19.4)29(80.6)

表4Yes相關(guān)蛋白與p63和Bcl-2在DLBCL中表達(dá)的相關(guān)性

Yes相關(guān)蛋白例數(shù)p63陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)PBcl-2陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)P陰性1811(61.1)7(38.9)0.5402(11.1)16(88.9)0.577陽性2714(51.9)13(48.1)6(22.2)21(77.8)

表5p63和Bcl-2在DLBCL中表達(dá)的相關(guān)性

p63例數(shù)Bcl-2陰性例數(shù)(%)陽性例數(shù)(%)P陰性255(20.0)20(80.0)0.540陽性203(15.0)17(85.0)

3　討論

Yes相關(guān)蛋白是經(jīng)典Hippo信號通路的主要效應(yīng)因子。Hippo通路異常導(dǎo)致對Yes相關(guān)蛋白滅活失效和(或)Yes相關(guān)蛋白自身活性增強(qiáng)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與腫瘤的形成[6]。研究顯示，Yes相關(guān)蛋白異常高表達(dá)與人類多種實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌、惡性黑色素瘤、肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、卵巢癌等[7-12]，并與腫瘤的高侵襲性與不良預(yù)后有關(guān)，提示Yes相關(guān)蛋白可能在腫瘤中起著癌基因作用。但最近Barry等[13]和Tufail等[14]的研究結(jié)果分別顯示Yes相關(guān)蛋白在結(jié)直腸癌和乳腺癌中呈低表達(dá)，而低表達(dá)的Yes相關(guān)蛋白可抑制腸干細(xì)胞再生，并與浸潤性乳腺癌ER和/或PR陰性表達(dá)顯著相關(guān)。這兩項(xiàng)研究表明Yes相關(guān)蛋白在腫瘤進(jìn)展中起著抑癌基因作用。鑒于諸多研究結(jié)果不一致、甚至相互矛盾，有學(xué)者提出Yes相關(guān)蛋白可能在腫瘤中扮演著抑癌基因和癌基因的雙重角色。

近年來，隨著研究的不斷深入，Hippo通路在免疫系統(tǒng)的調(diào)控功能被證實(shí)，尤其在T細(xì)胞發(fā)育、分化、活化和遷移等方面發(fā)揮了重要作用[15]。然而，目前有關(guān)Hippo通路和Yes相關(guān)蛋白在B細(xì)胞發(fā)育和功能中的研究十分少見，尤其是在B細(xì)胞性淋巴瘤中的表達(dá)特點(diǎn)及其臨床意義尚不十分清楚。為此，本研究從蛋白水平上對B細(xì)胞性淋巴瘤最常見類型—DLBCL中的Yes相關(guān)蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，并與良性淋巴組織中的表達(dá)進(jìn)行對比分析。研究結(jié)果顯示， Yes相關(guān)蛋白在良性淋巴組織中均呈中-高強(qiáng)度表達(dá)，提示Yes相關(guān)蛋白可能參與了成熟B細(xì)胞各階段的分化。在DLBCL中，Yes相關(guān)蛋白的表達(dá)陽性率為60.0%，明顯低于良性淋巴組織，提示Yes相關(guān)蛋白在DLBCL發(fā)生發(fā)展中可能起著抑癌基因的作用。值得一提的是，本研究中，良、惡性淋巴組織中Yes相關(guān)蛋白的表達(dá)均定位于細(xì)胞漿，由于在經(jīng)典Hippo信號通路中活化的Yes相關(guān)蛋白作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，通常情況下富集在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，我們推測Yes相關(guān)蛋白很可能通過非經(jīng)典Hippo信號通路參與了B細(xì)胞分化調(diào)控及抑制B細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化，因?yàn)橐延醒芯孔C實(shí)胞漿定位的Yes相關(guān)蛋白亦具有生物學(xué)活性，它能夠通過與其他信號通路交互作用，從而抑制細(xì)胞增殖[16]。

p63基因是p53家族成員之一，定位于染色體3q27-29。其編碼產(chǎn)物有兩類異構(gòu)體，即TAp63和△Np63，兩者在功能上有明顯差異，TAp63表達(dá)水平升高可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而△Np63的過度表達(dá)則可抑制細(xì)胞凋亡，具有癌基因功能[17]。有關(guān)p63蛋白在DLBCL中是起腫瘤抑制作用還是促進(jìn)作用，目前學(xué)術(shù)界仍存在爭議。本研究顯示p63蛋白在DLBCL中表達(dá)陽性率為44.4%，而在RHL呈陰性表達(dá)，提示p63高表達(dá)與DLBCL的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。由于本研究所用的p63抗體能對所有p63蛋白異構(gòu)體起反應(yīng)，所以在DLBCL進(jìn)展中究竟以哪一類異構(gòu)體發(fā)揮作用，尚待進(jìn)一步研究。

Bcl-2是一種重要的抗凋亡基因，在正常B細(xì)胞發(fā)育和分化中起重要作用。Bcl-2蛋白高表達(dá)與淋巴瘤發(fā)病、化療或放療抵抗等有關(guān)[18]。國內(nèi)楊海燕等[19]研究結(jié)果顯示Bcl-2蛋白在non-GCB型DLBCL中的表達(dá)率高于GCB型，且與DLBCL不良預(yù)后有關(guān)。而魏華萍等[20]研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白與整體DLBCL預(yù)后無關(guān)，但在60歲以上DLBCL患者中具有明確的預(yù)后價(jià)值，與預(yù)后不良顯著相關(guān)。本研究數(shù)據(jù)顯示Bcl-2蛋白在DLBCL中表達(dá)陽性率為82.2%，雖然與前項(xiàng)研究報(bào)道相近，但在GCB型與non-GCB型間表達(dá)無顯著差異，且與年齡等臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。

新近研究發(fā)現(xiàn)Hippo-Yes相關(guān)蛋白信號通路與p63或Bcl-2之間可能存在交互作用。Saladi等[21]實(shí)驗(yàn)顯示ACTL6A/p63復(fù)合物能夠活化Yes相關(guān)蛋白、促進(jìn)頭頸部鱗癌的發(fā)生，ACTL6A和Yes相關(guān)蛋白高表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。Wen等[22]研究顯示敲除Yes相關(guān)蛋白可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的凋亡，從而抑制其增殖，并證實(shí)此調(diào)控過程是通過Hippo-Yes相關(guān)蛋白信號通路與Erk和Bcl-2 信號通路之間交互作用而實(shí)現(xiàn)的。本研究中，Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2在DLBCL均呈異常表達(dá)，但三者間無相關(guān)性，提示它們可能分別通過不同機(jī)制參與了DLBCL的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究表明Yes相關(guān)蛋白、p63和Bcl-2蛋白在DLBCL中存在異常表達(dá)，與DLBCL的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但三者無明顯相關(guān)性。Yes相關(guān)蛋白在DLBCL中低表達(dá)的具體分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。