牛憲立，魏妮娜，姬可平，謝　奎

(遵義醫(yī)學(xué)院 珠海校區(qū)生化教研室，廣東 珠海　519041)

山慈菇IphigeniaindicaKunth為蘭科植物杜娟蘭、獨(dú)蒜蘭Rolfe或云南獨(dú)蒜蘭P.yunnansisRolfe的干燥假鱗莖?！侗静菥V目》記載了山慈菇的功效:“主疔腫,攻毒破皮。山慈菇具有清熱解毒、化痰、散結(jié)消腫之功,臨床上中醫(yī)常用山慈菇治療疔瘡腫毒、淋巴結(jié)核,乳腺增生、食道癌等疾病[1-3]。由于近幾年對山慈菇的有效成分的深入研究,作為藥用的山慈菇得到了廣泛的開發(fā)和利用,使得市場對山慈菇的需求急劇增加,加上藥材的采集比較困難,而且野生數(shù)量也在不斷減少,市場價(jià)格就比較高。目前市場上除了正品山慈菇外,還存在大量的偽品和混淆品。常見的有白及Bletillastriata、金果欖Tinosporacapillipe等,它們的根莖在外形上與山慈菇較為相近,但在藥效方面相差甚遠(yuǎn)[4-6]。因此,準(zhǔn)確地鑒別山慈菇藥材對于保障人們用藥安全意義重大。本研究主要從山慈菇的ITS序列進(jìn)行測序分析,比較這些易混品在遺傳上的差異,從而為山慈菇的真品鑒定在分子水平上提供更科學(xué)的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器供試材料山慈菇S5(1號)及其偽品S1、S2、S3、S4(對應(yīng)序號2、3、4、5號,S5真品山慈菇,S1、S2、S3、S4分別為園葉金果欖)野外采集于貴州桐梓、鳳崗、湄潭、習(xí)水、正安等地。其它偽品及其同源品的ITS序列來源GenBank數(shù)據(jù)庫，形態(tài)學(xué)鑒定由廣東省珠海市食品藥品監(jiān)督管理局藥檢所完成。詳細(xì)信息見表1。

表1山慈菇及其混偽品材料信息

編號拉丁名中文名科屬來源登錄號1Iphigenia indica Kunth 山慈菇(S5)蘭科、獨(dú)蒜屬遵義桐梓KF208461.22Tinospora capillipes園葉金果欖(S1)防己科、青牛膽屬遵義鳳崗KF208385.13Tinospora capillipes圓葉金果欖(S2)防己科、青牛膽屬遵義湄潭KF208386.14Tinospora capillipes圓葉金果欖(S3)防己科、青牛膽屬遵義習(xí)水KF208387.15Tinospora capillipes圓葉金果欖(S4)防己科、青牛膽屬遵義正安KF208388.16Pleione grandiflora大花獨(dú)蒜蘭蘭科、獨(dú)蒜屬GenBank AF461477.17Pleione grandiflora大花獨(dú)蒜蘭蘭科、獨(dú)蒜屬GenBankAF461476.18Pleione bulbocodiodes獨(dú)蒜蘭蘭科、獨(dú)蒜屬GenBankEU100770.19Pleione hokerian毛唇獨(dú)蒜蘭 蘭科、獨(dú)蒜屬GenBankAF461468.110Tinospora sagittata青牛膽防己科、青牛膽屬GenBankFJ980297.111Tinospora sagittata青牛膽防己科、青牛膽屬GenBankJF708200.112Bletilla striata白及蘭科、白及屬GenBankJN388582.1

主要試劑有Tris 、EDTA-Na2.H2O、 CTAB 購于上海生工公司，苯酚、氯仿、異戊醇購于成都科龍化工試劑公司。主要儀器有UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)、Hema-8000型PCR儀(珠海黑馬儀器廠)、DYC型電泳儀(北京六一儀器廠)、5810R型冷凍高速離心機(jī)(Eppendorf)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取(改良CTAB法)分別稱取5個樣品植物葉片0.2 g,用液氮研成粉末,移入2.0 mL離心管,加入1 mL 65 ℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液,充分搖勻,65 ℃水浴60 min,期間混勻3次。然后10 000 rpm離心15 min后取上清液,加入與上清等體積的氯仿:異戊醇(20∶1),加蓋顛倒數(shù)次混勻。于離心機(jī)中8 000 rpm離心15 min,取上清轉(zhuǎn)移至另一新的2.0 mL離心管中，用氯仿∶異戊醇(24∶1)再抽提1次。獲得的上清液加入約2/3體積異丙醇和1/5體積5 mol/L NaAc,加蓋輕混后,8 000 rpm,離心10 min,棄去上清液。用70%乙醇700 μL洗滌沉淀1次,12 000 rpm離心1 min,風(fēng)干。加100 μL TE液溶解,低溫保存。

1.2.2DNA純度的檢測DNA樣品100倍稀釋后,在紫外分光光度計(jì)UV-2550上測定其在260 nm、280 nm處吸光度值,根據(jù)吸光度OD260、OD260/OD280的值計(jì)算DNA的濃度和純度。

DNA濃度(μg/mL)=OD260×稀釋倍數(shù)×200

然后在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,檢測 DNA片段長度,觀察并記錄。

1.2.3ITS擴(kuò)增和測序采用通用引物擴(kuò)增山慈菇ITS完整序列,引物P1位于18S上(5’-CGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’),引物P2位于26S上(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’),由深圳華大基因科技有限公司合成?；蚪MDNA 1 μL、引物P1和P2各1 μL、dNTPs、 0.2 mmol/L、Pfu DNA聚合酶1.5 μL，加無菌水補(bǔ)充共50 μL反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性1 min，56 ℃退火2 min，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳， 初步鑒定篩選后， 分別送深圳華大基因科技有限公司測序。

1.2.4ITS序列分析將測序的結(jié)果進(jìn)行手工校正,對測序峰圖使用Codon Code Aligner 3.71進(jìn)行序列拼接，去除引物序列，獲得ITS區(qū)序列。用MEGA 5.0軟件對所有序列分析比對并進(jìn)行種內(nèi)、種間遺傳距離的計(jì)算; 用NJ(neighbour-2-joiningmethod,NJ)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果

2.1DNA的濃度由表2得知,S5(真品山慈菇)、S1、S2、S3、S4(S1～S4分別為貴州不同地方的園葉金果欖)所提取的DNA樣品經(jīng)過紫外分光光度計(jì)濃度檢測:OD260/OD280的比值為1.6～1.8,說明污染比較少,符合做PCR擴(kuò)增模板。

表2不同來源山慈菇提取的DNA濃度

樣品編號A260A280A260/A280S10.0080.0071.143S20.0340.0211.619S30.0460.0311.484S30.0060.0041.500S40.0840.0651.292S50.0670.0451.489

2.2總DNA電泳圖由圖1可知,提取的植物基因組DNA條帶明亮清晰完整,大小均在15 000 bp左右?？梢杂脕磉M(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得其植物rDNA的ITS序列。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物(DL15000); S1～S5:供試材料詳細(xì)信息見表1。圖1　基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3PCR擴(kuò)增ITS序列圖經(jīng)改良CTAB法提取所有樣品總DNA,PCR擴(kuò)增ITS序列后，在750 bp處得到預(yù)期產(chǎn)物,條帶亮度高且清晰(見圖2)，送深圳華大基因科技有限公司測序。

M:DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物(DL2000); S1～S5:供試材料詳細(xì)信息見表1。圖2　ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.4測序結(jié)果及序列分析

2.4.1山慈菇及習(xí)用品的完整序列經(jīng)深圳華大基因科技有限公司測序得到山慈菇S5與習(xí)用品園葉金果欖的S1的ITS序列,將ITS序列通過 CodonCode Aligner軟件進(jìn)行拼接和校對。

2.4.2ITS序列拼接及分析把測序后的序列利用CodonCode Aligner進(jìn)行對比校對,山慈菇與園葉金果欖的ITS片段長度差89個堿基,CG含量差0.40%; 山慈菇與園葉金果欖ITS2片段長度差52個堿基,CG含量差3.30%,詳見表3。

表3各片段的特征

序列特征ITS長度(bp)G+C含量(%)ITS2長度(bp)G+C含量(%)園葉金果欖(S1)39255.919655.6山慈菇(S5)48156.324858.9

2.4.3貴州山慈菇及其混偽品ITS堿基比較由圖3可知,山慈菇與大花獨(dú)蒜蘭(序列號AF461477.1)比較有1個突變位點(diǎn),突變序列為G-T,山慈菇與大花獨(dú)蒜蘭(序列號AF461476.1) 比較有4個突變位點(diǎn),突變序列分別為G-T,A-C,A-C,C-G; 山慈菇與獨(dú)蒜蘭比較有2個突變位點(diǎn),突變序列分別為T-C和G-T;山慈菇與毛唇獨(dú)蒜蘭比較有2個突變位點(diǎn),分別為G-T和A-T。山慈菇與4個金果欖比較有分別208個、206個、205個和206個突變位點(diǎn),山慈菇與2個青牛膽比較分別有187個和194個突變位點(diǎn),山慈菇與白及比較有70個突變位點(diǎn)。4個金果欖之間比較有6個突變位點(diǎn); 2個青牛膽之間比較有30個突變位點(diǎn),由此可見同種屬之間的變異較少,不同種屬之間的變異較多。

“.”代表與第一行相同的堿基;“-”代表缺失; 數(shù)字表示變異位點(diǎn)。圖3　序列對比及變異位點(diǎn)分析

2.4.4山慈菇及偽品的遺傳距離貴州山慈菇及偽品的ITS序列之間的遺傳距離見表4。由表4可知遺傳距離(K-2P)范圍為0.002～0.404,其中1號至5號之間的遺傳距離很小,6號至11號之間的遺傳距離很小,10號于11號之間的遺傳距離也很小。1號與6號、1號與10、1號與12號之間遺傳距離都較大,由他們的距離可以看出真品與偽品之間的遺傳距離較大。

表4山慈菇及偽品的遺傳距離

1Iphigenia indica Kunth2Tinospora capillipes0.0023Tinospora capillipes0.0070.0054Tinospora capillipes0.0040.0020.0075Tinospora capillipes0.0050.0040.0090.0056Pleione grandiflora0.4100.4110.4200.4110.4047Pleione grandiflora0.4040.4030.4120.4030.3970.0118Pleione bulbocodiodes0.4040.4030.4120.4030.3970.0110.0019Pleione hokerian0.4040.4030.4120.4030.3970.0110.0010.00110Tinospora sagittata0.4110.4100.4190.4100.4040.0270.0160.0160.01611Tinospora sagittata0.4060.4060.4150.4060.4000.0110.0200.0200.0200.03712Bletilla striata0.1170.1170.1210.1170.1190.4900.4860.4860.4860.4940.485

2.4.5物種間NJ樹鑒定從ITS序列構(gòu)建的NJ樹圖(見圖4) 可以看出,山慈菇與獨(dú)蒜蘭、大花獨(dú)蒜蘭、毛唇獨(dú)蒜蘭種間親緣關(guān)系較近,聚為一支; 白及單獨(dú)聚為一支; 不同地域的金果欖與兩種青牛膽聚為一支上,山慈菇與其混偽品白及、金果欖之間差異較為顯著,分別聚到不同的分枝上。

圖4　山慈菇及偽品的NJ樹

3　討論

隨著現(xiàn)代分子鑒定技術(shù)的不斷發(fā)展,對中草藥的品系評價(jià)研究已從傳統(tǒng)的形態(tài)性狀、組織解剖、理化特性等方面深入到了分子水平。以DNA指紋技術(shù)、DNA測序技術(shù)為代表的DNA分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥材的品質(zhì)鑒定中,尤其是rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA ITS)測序分析技術(shù)的發(fā)展。Lau等[7]分析了16種石斛屬植物的rDNA序列,在ITS2區(qū)種間差異為12.4%,而與非蘭科植物和偽品之間的差異分別為29.8%和18.8%,因此,ITS2區(qū)序列完全可以作為鑒定山慈菇藥材的依據(jù)。丁平等[8]將 rDNA-ITS序列分析用于對巴戟天及其常見混偽品的鑒定。rDNA-ITS序列分析技術(shù)因不受藥材的生長、環(huán)境、產(chǎn)地等因素的影響,在野生藥材與其栽培品及混淆品的比較研究方面具有更好的應(yīng)用前景。rDNA ITS序列分析技術(shù)還應(yīng)用于傘房花耳草、白花蛇舌草與纖花耳草、松葉耳草等混雜品的鑒定[9],佛手與其混淆品近緣種香櫞[10],巴戟天及其易混品虎刺、羊角藤[11],以及白木香[12]、高良姜[13]、石斛[14]、紅芪[15]等藥材的鑒定,為藥用植物在野生品、易混品及栽培品等在分子水平的差異提供了重要的參考資料。

由于Rubisco酶大亞基基因編碼序列rDNA ITS序列在不同生物之間存在堿基序列上的差異,因此可廣泛用于物種分類與鑒定、遺傳多樣性與系統(tǒng)發(fā)育、各親緣關(guān)系等方面的研究[16-19]。有關(guān)研究表明,rDNA ITS區(qū)序列分析技術(shù)在鑒別中藥植物近緣種、易混品及藥材道地性等方面具有方法可靠、靈敏、快捷的優(yōu)點(diǎn),為進(jìn)一步確保藥品質(zhì)量及用藥安全有效等方面發(fā)揮重要作用。

本研究通過對山慈菇ITS序列的比對分析,發(fā)現(xiàn)山慈菇與4個金果欖比較有200多個突變位點(diǎn),與2個青牛膽比較有180多個突變位點(diǎn),與白及比較有70個突變位點(diǎn)。而4個金果欖之間只有6個突變位點(diǎn); 2個青牛膽之間有30個突變位點(diǎn),由此可見同種屬之間的變異較少,不同種屬之間的變異較多。不同產(chǎn)地的金果欖的ITS序列相似率為99%,且聚在一起。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹圖上進(jìn)一步分析,白及與山慈菇、獨(dú)蒜蘭、大花獨(dú)蒜蘭、毛唇獨(dú)蒜蘭同為蘭科植物,同聚為一支。但是白芨與山慈菇等在ITS序列有一定的差異,白及單獨(dú)聚為一支; 不同地域的金果欖與兩種青牛膽有較近的種間親緣關(guān)系,同聚為一支上。由此看出,山慈菇與其混偽品白及、金果欖之間差異較為顯著,分別聚到系統(tǒng)發(fā)育樹不同的分枝上。說明不同產(chǎn)地的山慈菇以及其混偽品有一定的遺傳距離,在種間分化上比較活躍。本研究對貴州道地藥材山慈菇及其偽品rDNA ITS序列進(jìn)行對比分析,為山慈菇的道地性研究確立初步標(biāo)準(zhǔn)。ITS序列分析技術(shù)為建立山慈菇真品鑒定的分子水平標(biāo)記以及中藥山慈菇DNA條形碼的建立奠定初步基礎(chǔ)。