劉艷龍，徐國海

(1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，南昌 330006；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，南昌 330006)

隨著國家二胎政策的開放，新生兒每年出生增加近千萬。嬰幼兒接受各種檢查和手術(shù)麻醉操作增加。研究表明，麻醉藥物能夠?qū)е聝和瘜W(xué)習(xí)及行為異常的發(fā)生率增加[1，2]。一項前瞻性性臨床研究，通過調(diào)查測試麻醉術(shù)后兒童是否出現(xiàn)尿床，夢魘，壞脾氣，社交恐懼等，發(fā)現(xiàn)3歲以下嬰幼兒在接受全身麻醉后會引起行為改變比例最高，提示全麻藥物對嬰幼兒的中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生神經(jīng)毒性[3]。因此我們在解決新生兒及兒童引起的相關(guān)臨床問題時，藥物對學(xué)習(xí)記憶的影響更應(yīng)引起重視。

糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)通過抑制炎癥介質(zhì)合成及炎癥細胞活性，穩(wěn)定溶酶體，修復(fù)血腦屏障等起重要作用，降低神經(jīng)炎性反應(yīng)和減少神經(jīng)細胞凋亡，有一定的腦保護作用，廣泛運用于臨床。近年來BDNF與皮質(zhì)激素的關(guān)系受到關(guān)注，但所知甚少。本研究通過觀察地塞米松聯(lián)合氯胺酮麻醉手術(shù)后對學(xué)習(xí)記憶的影響及其可能機制，為臨床嬰幼兒麻醉的藥物選擇提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 出生21d SD幼鼠48只，雌雄不拘。由南昌大學(xué)實驗動物實驗室提供，體重100-120g。實驗大鼠處置嚴(yán)格按照科技部2006年頒發(fā)的《善待實驗動物指導(dǎo)性意見》執(zhí)行。

1.1.2藥物，試劑和儀器 地塞米松（河南潤弘制藥股份有限公司），氯胺酮（西安漢豐藥業(yè)有限責(zé)任公 司 ）；TUAnti-BDNF antibody [EPR1292](ab108319，RabMAB)；Rabbit聚合 HRP 標(biāo)記抗兔IgG(SV0002， 博士德)；5%BSA 封閉液(SW3015，Solarbio)；DAB 顯色試劑盒(CW0125，CWBIO)；中性樹脂(CW0136，CWBIO)；蘇木素染色(AR1180-1，博生德生物)NEL檢測試劑盒 （C1086，碧云天），Morris水迷宮及視頻分析軟件。

1.2方法

1.2.1實驗分組及建模 將SD幼鼠（100-120g）48只隨機分成3組，空白對照組，氯胺酮組，氯胺酮+地塞米松組，腹腔注射給藥翻正反射消失后，于上腹部中線附近備皮，常規(guī)消毒鋪巾，于正中線做一長約1.5cm切口，探查腹部5min，關(guān)腹，傷口用縫線縫合，傷口縫合后紅霉素軟膏涂抹，所有手術(shù)均嚴(yán)格按照無菌操作。手術(shù)結(jié)束后，待幼鼠翻正反射恢復(fù)后放回籠子，飼養(yǎng)，自由光照，室溫(23±2)℃，藥物處理后第1d各組斷頭（8只）取海馬組織，固定保存。剩余8只SD幼鼠藥物處理后第2d行Morris水迷宮定向航行實驗和空間探索實驗。

1.2.2水迷宮實驗 定位航行實驗：藥物處理后第2d后進行水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練。將SD幼鼠放入水槽自由游泳2min，使其適應(yīng)迷宮內(nèi)、外環(huán)境及游泳狀態(tài)。訓(xùn)練期間每只小鼠每天進行4次訓(xùn)練，記錄小鼠從入水到爬上平臺所需時間。如果小鼠在90s內(nèi)仍未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺并停留10s，潛伏期記為90s?？臻g探索實驗：在定位航行4d結(jié)束后，為考察SD幼鼠對原平臺的記憶能力，撤去平臺，將SD幼鼠放入水中自由游泳，記錄SD幼鼠在90s內(nèi)穿過平臺所在象限的游泳時間和路徑，以及小鼠穿過平臺所在象限的次數(shù)

1.2.3TUNEL法檢測凋亡 將海馬組織石蠟切片脫蠟，水化預(yù)處理。將切片移入濕盒中，每個樣本上滴加50ug/mlProteinase K工作液修復(fù)。PBS充分洗滌。用吸水紙吸掉組織周圍的PBS，滴加TUNEL檢測液，孵育2h。再次PBS洗滌3次，用吸水紙吸干玻片上的液體，用抗熒光淬滅封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4免疫組化 將海馬組織石蠟切片脫蠟，水化預(yù)處理后切片放入修復(fù)盒中，加入抗原修復(fù)液(檸檬酸緩沖液)，加熱2min后自然冷卻，棄去抗原修復(fù)液，將切片用PBS淋洗。將切片移入濕盒中，加入新鮮配制的3%雙氧水，以去除內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育10min，PBS充分淋洗。PBS浸洗玻片3次吸，用水紙吸干組織周圍的PBS，在玻片上滴加5%BSA，37°C封閉30min。敷一抗：用吸水紙吸掉組織周圍的封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗：BDNF(1：100)，放入濕盒中，4°C孵育過夜。敷二抗：取出4°C孵育過夜?jié)窈?，室溫靜置45min，PBS浸洗玻片3次，每次5min，滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗工作液，37°C孵育30min，PBS充分淋洗。DAB顯色5-10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，PBS或自來水沖洗1min；蘇木精復(fù)染3min，鹽酸酒精分化，返藍；自來水沖洗1min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.2.5RT-PCR法測定BDNFmRNA⑴組織樣品的處理：將組織樣品研磨至粉末狀，保持在低溫狀態(tài)。按照組織量加入對應(yīng)量的Trizon Reagent。研磨至半固體半液體狀，用移液槍收集到標(biāo)有分組的1.5ml離心管中。⑵提取RNA向以離心管中加入氯仿離心，樣品分成3層：紅色有機相層，中間層，上層無色水相層。取水相層（約900ul）到一個新的1.5ml RNase-Free離心管中。在水相溶液中加入70%乙醇，顛倒混勻，裝入收集管的吸附柱RM中，離心，洗滌后室溫放置5min晾干。將吸附柱置于一個新的1.5ml RNase-Free離心管中，加入無RNase的水，充分溶解RNA，靜置，離心，靜置。得到的RNA保存在-80℃，防止降解。⑶RNA濃度、純度測定：打開紫外可見分光光度計預(yù)熱20min，將RNA溶液與RNase free water混合均勻，在260 OD下測定其數(shù)據(jù)，再在280 OD下測定數(shù)據(jù)，最后根據(jù)公式計算A260×稀釋倍數(shù)×40=RNA ng/ul（濃度）A260/280≥1.8（純度）。將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成CDNA：渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。 加入 dNTP Mix，Primer Mix，RNA Template后70℃孵育 10min，再迅速冰浴2min。再加入5xRT Buffer，DTT，HiFiScript 50℃孵育 15min，85℃孵育5min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。⑷熒光定量PCR引物序列BDNF F：AGCCTCCTCT GCTCTTTCTG BDNF R：GTGACCCACTCGCTAAT ACTGT GAPDH F：GCAAGTTCAACGGCACAG GAPDH R：CGCCAGTAGACTCCACGAC與操作體系 RNase Free dH20 9.5μl，cDNA/DNA 1μl，上游引物 1μl下游引物 1μl，2xULtraSYBR Mixture 2.5μl通過三步法反應(yīng)程序融解曲線分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。幼鼠行為學(xué)結(jié)果采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，TUNEL法檢測凋亡，RTPCR法測定BDNF及BDNFmRNA的表達采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P

2　結(jié)果

2.1臨床觀察結(jié)果 出生21d SD幼鼠隨機分組，組間體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異 （P>0.05）。腹腔注射給藥后，所有幼鼠生命體征平穩(wěn)，幼鼠皮膚顏色與對照組一樣均呈粉紅色，未發(fā)現(xiàn)有缺氧情況。實驗過程順利，幼鼠無不良事件發(fā)生。實驗結(jié)束后，幼鼠均能迅速從麻醉狀態(tài)中恢復(fù)。麻醉恢復(fù)后，幼鼠均能正常覓食，無神經(jīng)系統(tǒng)受損表現(xiàn)。

2.2Morris水迷宮實驗

2.2.1定位航行實驗 如圖所示，各組幼鼠在訓(xùn)練過程中，均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加(每天訓(xùn)練強度固定)，在水中逃逸、尋找平臺的潛伏期越來越短，直至達到穩(wěn)定水平，具體數(shù)據(jù)見（表1）。

表1　各組大鼠平均逃避潛伏期的比較（n=8，x±s）

2.2.2空間探索試驗 3組幼鼠空間探索的3項檢測結(jié)果（見表2）。穿越平臺次數(shù)的順位為A組>C組>B組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（*P<0.05）。與氯胺酮組比較，地塞米松+氯胺酮組穿越平臺的次數(shù)增加(#P<0．05)。

表2　各組幼鼠穿越平臺次數(shù)的比較（n=8，x±s）

2.3TUNEL法檢測凋亡 光鏡下對照組僅見散在的凋亡細胞，用藥各組可見凋亡細胞增加，其中B組凋亡細胞增加最為明顯。

2.4免疫組化測定BDNF海馬組織勻漿中BDNF表達水平對照組最高，用藥各組可見BDNF含量下降，其中B組BDNF下降最為明顯（棕色為檢測的目的蛋白，藍紫色為細胞核）。B氯胺酮組和C組氯胺酮+地塞米松組海馬勻漿中BDNF均較對照組下降 (P<0.05)，其中C組海馬勻漿中BDNF含量較B組升高(P<0.05)。

2.5RT-PCR法BDNFmRNA本實驗采用RTPCR擴增來反映上述3個基因的相對定量表。海馬組織勻漿中BDNFmRNA表達水平對照組最高，用藥各組可見BDNFmRNA含量下降，其中B組BDNFmRNA下降最為明顯。

3　討論

本研究中，氯胺酮麻醉手術(shù)后，幼鼠行為學(xué)與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，其逃逸潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少。說明氯胺酮對幼鼠麻醉手術(shù)后學(xué)習(xí)記憶下降。其海馬神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)高于對照組 (P<0.05)，而海馬勻漿中BDNF水平及BDNFmRNA低于對照組，據(jù)此我們推斷氯胺酮麻醉手術(shù)后誘導(dǎo)發(fā)育期幼鼠海馬神經(jīng)元凋亡，導(dǎo)致幼鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改變，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與氯胺酮下調(diào)了對神經(jīng)元存活以及突觸形成起重要作用的BDNF蛋白的表達，神經(jīng)元凋亡增加，突觸形成受損。這與譚蕾[4]等研究表明氯胺酮可抑制CREB磷酸化后下調(diào)BDNF及Bel-2表達影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育相一致。

糖皮質(zhì)激素及其受體分布廣泛、作用復(fù)雜，在維持神經(jīng)系統(tǒng)功能方面扮演了一個重要角色。它不僅對消炎，免疫抑制起作用，還是一種神經(jīng)遞質(zhì)，對腦功能有廣泛調(diào)節(jié)作用。而地塞米松是臨床上最常用的一種激素，是人工合成的糖皮質(zhì)激素，主要與皮質(zhì)醇受體結(jié)合而發(fā)生類似皮質(zhì)醇的作用，對各種基因進行轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致腦內(nèi)的若干事件，包括細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、新陳代謝和突觸可塑性，這些都與認(rèn)知功能有關(guān)。許多研究表明，地塞米松可以影響記憶和學(xué)習(xí)過程的改變[5，6]。雖然人們普遍認(rèn)為地塞米松會減少認(rèn)知功能[7]，但一些研究提供了其他的證據(jù)。如如地塞米松能顯著縮短感覺阻滯起效時間，延長阻滯持續(xù)時間和鎮(zhèn)痛持續(xù)時間[8]，降低術(shù)后惡心嘔吐等不良反應(yīng)的發(fā)生[9]。地塞米松可通過降低TNF-a、TGF-b、IL-6表達來抑制炎癥的發(fā)生[10]。此外，有研究表明地塞米松可逆轉(zhuǎn)記憶障礙。妊娠期地塞米松暴露可激活轉(zhuǎn)錄因子細胞反應(yīng)元素結(jié)合蛋白結(jié)合，增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和c-FOS蛋白水平，調(diào)控突觸可塑性和記憶的關(guān)鍵因子，改善認(rèn)知和tau病理，對學(xué)習(xí)記憶提供長期的保護[11]。本研究中，氯胺酮聯(lián)合地塞米松麻醉手術(shù)后，幼鼠行為學(xué)與氯胺酮組比較有統(tǒng)計學(xué)意義，其逃逸潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加。說明地塞米松改善氯胺酮麻醉手術(shù)后學(xué)習(xí)記憶的影響。本研究中幼鼠地塞米松聯(lián)合氯胺酮組幼鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡指數(shù)低于氯胺酮組(P<0.05)，而海馬勻漿中BDNF水平及BDNFmRNA高于氯胺酮組。有研究表明神經(jīng)營養(yǎng)因子，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)，是與特定Trk酪氨酸激酶跨膜受體結(jié)合的肽激素，促進神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的生存、生長和可塑性[12]。與糖皮質(zhì)激素一樣，BDNF水平的變化與許多精神疾病相關(guān)，包括抑郁和焦慮，而抑郁和焦慮都影響學(xué)習(xí)記憶。最近的證據(jù)表明，BDNF和糖皮質(zhì)激素在神經(jīng)系統(tǒng)中有趨同的、平衡的效應(yīng)[13，14]。Jeanneteau F[15]等研究顯示糖皮質(zhì)激素通過一個GR轉(zhuǎn)錄機制，可以獨立于神經(jīng)營養(yǎng)因子激活TrkB信號?？梢韵胂螅贕R和BDNF-TrkB信號之間存在一個交互的自我平衡的感知機制，以調(diào)節(jié)BDNF的轉(zhuǎn)錄輸出。通過本研究我們可以推測氯胺酮麻醉手術(shù)后下調(diào)BDNF的表達，而地塞米松的處理通過GR和BDNF-TrkB信號之間自我平衡的感知機制提高BDNF的表達，改善學(xué)習(xí)記憶。

綜上所述，氯胺酮對幼鼠麻醉手術(shù)后學(xué)習(xí)記憶下降，地塞米松可以提高BDNF的表達改善氯胺酮麻醉手術(shù)后對學(xué)習(xí)記憶影響。