熊明華，楊芮，張少飛，紀磊，李峰

(淮北師范大學生命科學學院，安徽 淮北 235000)

抗生素是指由細菌、放線菌、真菌等微生物經(jīng)培養(yǎng)而獲得的或是用化學法合成的結(jié)構(gòu)相同或者類似能夠殺滅或抑制病原微生物的物質(zhì)[1,2]。抗生素在保障人類健康和促進畜牧業(yè)發(fā)展等方面發(fā)揮了重要作用[3]。通過口服或肌肉注射進入動物體內(nèi)的抗生素只有15%可被吸收利用，大約85%以原藥或者代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)由病人、動物的糞尿等方式排出體外直接進入自然環(huán)境或者污水處理廠[4,5]。由于現(xiàn)有水處理技術(shù)不能有效去除污水中含有的抗生素[6]，這些抗生素最終還是進入土壤、水體等自然環(huán)境中。另外，含有各種抗生素的禽畜糞便作為有機肥施用于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，導致農(nóng)田土壤、水體甚至地下水抗生素污染。在Warman等[7]發(fā)現(xiàn)雞糞施肥土壤中存在氯四環(huán)素污染后,土壤、沉積物、污泥甚至肥料中各種抗生素相繼被檢出[8，9]。

磺胺類藥物是以對氨基苯磺酰胺為基本化學結(jié)構(gòu)的一類合成抗菌藥物，其種類繁多，用于預防和治療細菌感染性疾病，是重要的人獸共用藥物。其中磺胺吡啶、磺胺嘧啶和磺胺甲惡唑是最常用的3種磺胺類抗生素，也是環(huán)境中檢測最頻繁的磺胺類抗生素[10,11]。我國的珠江水域和環(huán)渤海水域中也以較高濃度檢測到磺胺類抗生素[12,13]。雖然磺胺類抗生素在土壤中的遷移能力較強，但田間研究表明施用于土壤中的胺類抗生素只有一小部分進入周邊水體，大部分仍然以不可提取形式殘留在土壤中且不易降解[14,15]。Pawelzick等[16]在德國西北部液體糞肥施用后的沙壤中發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素和磺胺甲嘧啶殘留，在0～30cm的土層中土霉素、四環(huán)素、氯四環(huán)素、磺胺甲嘧啶的含量分別達27、443、93、4.5μg/kg。

微生物降解是一種經(jīng)濟、有效的去除包括抗生素在內(nèi)的環(huán)境有機污染物的綠色方法。在使用微生物修復污染環(huán)境之前需要考慮的一個重要問題是所用微生物的安全性及其對目標污染物的耐受程度。原玻璃節(jié)桿菌Y1是淮北師范大學微生物實驗室分離的一株磺胺類抗生素耐藥細菌。本研究的主要目的是通過測定該原玻璃節(jié)桿菌對磺胺吡啶的最小抑制濃度以及在抗生素壓力下該菌的生長動力學，為其風險管理及其工程應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

磺胺吡啶(Sulfapyridine，SPY)(分析純,98%)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；培養(yǎng)基配制所需藥品購自國藥集團化學試劑有限公司；原玻璃節(jié)桿菌Y1由淮北師范大學微生物實驗室分離保存，E.coliATCC 25922由國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心(大連)那廣水研究員饋贈。

1.2 菌株Y1最小抑制濃度(MIC)測定

將4℃保藏的原玻璃節(jié)桿菌Y1試管斜面接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于30℃、160 r/min條件下?lián)u床進行過夜培養(yǎng)，獲得菌株Y1菌體培養(yǎng)液。取該菌體培養(yǎng)液離心、無菌水洗滌3次之后，LB液體培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液濃度約為1.5×108個/mL。取20μL該菌懸液接種到含不同濃度SPY的96孔酶標板孔中，每孔總體積為200μL。同時接種E.coliATCC 25922和不接種(LB液體培養(yǎng)基補齊)進行質(zhì)控和過程控制。酶標板置于培養(yǎng)箱(TQHZ-2002A型)30℃恒溫震蕩培養(yǎng)24h后用酶標分析儀(RT-2100C型)測定其光密度D600nm值。菌株Y1和E.coliATCC 25922均不生長的臨界濃度定義為SPY對該菌株的MIC。

1.3 最小抑菌濃度的驗證

為了檢驗1.2 所測定的MIC能否完全抑制菌株Y1的生長，取過夜培養(yǎng)的菌株Y1離心、洗滌后，進行10×系列稀釋，取100μL適當稀釋度菌懸液涂布含有最小抑制濃度(1.2測定)SPY的LB平板，倒置于智能光照培養(yǎng)(PGX-350B型)37℃條件下恒溫培養(yǎng)24～48h。觀察平板上菌體的生長狀況。同時接種一組無抗生素的LB平板作為對照。上述實驗均以E.coliATCC 25922作為質(zhì)控菌株，即含SPY和不含SPY的LB平板同時接種該菌株，在相同條件下進行培養(yǎng)。

1.4 無抗生素壓力下菌株Y1生長動力學

按照1.2的方法制備菌株Y1菌懸液，將其菌體濃度調(diào)整到D600nm分別為0.1、0.2、0.3。分別取上述濃度的菌體懸液500μL 接種到200mL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，在30℃和160r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每小時分別取樣3mL于無菌離心管中，放入冰箱凍存，待全部取樣完成后統(tǒng)一進行D600nm值測定。根據(jù)此D600nm值數(shù)據(jù)，采用Origin 9.1軟件選擇SGompertz模型(式1)[17]對菌株Y1的生長情況進行擬合,采用均方誤差(Mean Square Error，MSE)和R2對一級模型進行評價。根據(jù)擬合得到的模型參數(shù)，選用式(1)計算出最大比生長速率(μmax)和式(2)計算出延滯期(λ)。

lg(Nt/N0)=a×exp{-exp[-k×(t-xc)]}

(1)

μmax=a×k/e

(2)

λ=xc-1/k

(3)

式中，N0、Nt分別表示初始時間和在時間t時的微生物量(D600nm)；λ為延滯期，h；a為最大生物量Nmax與初始生物量N0的差值；xc為達到相對最大生長速率所需的時間，h；k為在時間xc的相對生長速率，D600nm/h。

1.5 不同抗生素濃度壓力下菌株Y1生長動力學

按照“1.2”的方法制備菌株Y1菌懸液濃度，取D600nm=0.3的菌懸液接種含不同濃度SPY的LB培養(yǎng)基，按照“1.3”的方法培養(yǎng)和測定D600nm值并進行擬合和相關(guān)參數(shù)的計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Y1 MIC的測定

培養(yǎng)24h后，菌株Y1以及質(zhì)控菌株ATCC 25922在LB培養(yǎng)基中的生長量如表1所示。隨著LB培養(yǎng)基中SPY濃度的提高，菌株Y1的生長量(D600nm)逐漸降低，但是質(zhì)控菌株無生長。當SPY濃度提高到13mg/mL時，菌株Y1的D600nm與質(zhì)控菌株以及背景D600nm值(CK)相當，表明此濃度是抑制菌株Y1生長的最低濃度，即菌株Y1的MIC值。

表1 MIC測定結(jié)果

2.2 菌株Y1 MIC的驗證

圖1 菌株Y1和ATCC25922在含有和不含SPY(13mg/mL)LB培養(yǎng)基上的生長

菌株Y1和質(zhì)控菌株ATCC 25922在含有最小抑制濃度(13mg/mL) SPY 和不含SPY LB平板上的生長如圖1所示。在不含SPY LB平板上，質(zhì)控菌株ATCC25922(圖1-a1)和菌株Y1(圖1-b1)均明顯生長，但是在含有最小抑制濃度SPY LB培養(yǎng)基平板沒有任何菌落生長(圖1-a2和圖1-b2)。表明13mg/mL SPY可以抑制菌株Y1的生長。自然環(huán)境中抗生素濃度一般在ng/L～mg/L水平，很顯然，菌株Y1能夠耐受的SPY水平遠高于此水平。

2.3 無抗生素壓力下菌株Y1生長動力學

選用SGompertz模型,應(yīng)用Origin 9.1 軟件分別擬合不同接種量下菌株Y1的生長曲線(圖2)，得到其模型擬合參數(shù)(表2)。結(jié)果表明，SGompertz 模型能較好地擬合菌株Y1在D600nm為0.1、0.2、0.3的接種量下的生長曲線，其R2分別為0.98874、0.99046和0.97661。MSE用以評價數(shù)據(jù)的變異程度，MSE值越小，說明預測模型精確度越好。上述3個濃度接種量下菌株Y生長量SGompertz 模型擬合的MSE值分別為0.00775、0.00612和0.01641。

圖2 SGompertz模型擬合的菌株Y1在D600nm為0.1(a)、0.2(b)、0.3(c)接種量時的生長曲線

這表明SGompertz 模型的擬合度較高，模型的誤差較小。

根據(jù)SGompertz模型擬合得到的模型參數(shù)計算出的菌株Y1最大比生長速率μmax和遲滯期λ如表2所示?？梢?，隨著初始接種量的增大，菌株Y1的最大比生長速率無顯著變化，而遲滯期則呈降低趨勢。表明提高接種量可以降低菌體在環(huán)境中的延滯期，以助于其在抗逆環(huán)境如抗生素污染環(huán)境中快速增殖從而定殖發(fā)揮修復作用。

表2 無抗生素壓力不同接種量菌株Y1一級生長模型擬合參數(shù)

2.4 不同濃度SPY壓力下菌株Y1生長動力學

SGompertz模型對不同濃度SPY壓力下菌株Y1的生長曲線擬合如圖3所示。3、6、9mg/mL SPY壓力下SGompertz模型菌株Y1生長曲線的R2分別為0.99446、0.99188和0.97318；MSE值分別為0.00368、0.00415和0.00637。表明SGompertz模型對抗生素壓力下的菌株Y1的生長也能較好地擬合。根據(jù)SGompertz模型擬合得到的模型參數(shù)計算出的菌株Y1最大比生長速率μmax和遲滯期λ如表3所示?？梢?，隨著抗生素濃度的增大，菌株Y1的最大比生長速率逐漸減小，而遲滯期也逐漸延長，表明抗生素對菌體Y1的毒害作用隨著濃度的增加而加大。但是，當環(huán)境中SPY濃度不超過3 mg/mL時，菌株Y1的最大比生長速率以及最大生物量與無抗生素壓力下的相應(yīng)值相當，盡管其延滯期稍有延長，表明該菌株修復3mg/mL以下SPY污染環(huán)境具有較大的應(yīng)用潛力。

圖3 SGompertz模型擬合的菌株Y1在3(a)、6(b)、 9mg/mL (c)SPY時的生長曲線

SPY濃度/(mg·mL-1)SGompertz模型擬合系數(shù)axckμmaxλR2MSE32.124677.939610.309930.242254.713080.994460.0036862.8702812.440250.147520.155775.661510.991880.0041591.9339313.079190.169150.120345.911910.973180.00637

3 結(jié)論

SPY對原玻璃節(jié)桿菌Y1的最小抑菌濃度為13mg/mL。SGompertz模型對該菌生長曲線擬合度高，模型誤差小。無SPY壓力下，隨著接種量增大，菌株Y1最大比生長速率(μmax=0.24830～0.29797)和最大生長量(a=2.03441～2.21512)無顯著差異，但是延滯期(λ=6.12695～3.11051)減小。當存在SPY時，隨著其濃度提高，菌株Y1最大比生長速率(μmax=0.24225～0.12034)以及延滯期(λ=4.71308～5.91191)均顯著降低。菌株Y1在3mg/mL SPY與無SPY時的最大比生長速率(μmax=0.24225)和最大生物量(a=2.12467)相當，但其延滯期稍有降低(λ=4.71308)。本研究結(jié)果可為原玻璃節(jié)桿菌Y1工程應(yīng)用及其風險管理提供依據(jù)。

致謝：本研究所用E.coliATCC 25922為國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心(大連)的那廣水研究員饋贈，特表謝忱！