董 波，張寄香，戴愛玲，李曉華，李靜楠，楊小燕

(1.龍巖學院生命科學學院，福建龍巖 364012； 2.福建省生豬疫病防控工程技術研究中心，福建龍巖 364012；3.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙 410128)

豬病毒性腹瀉病是由1種或多種病毒單獨或混合感染各年齡段豬所引發(fā)的伴有腹瀉、嘔吐和脫水等典型癥狀的消化道機能紊亂疾病[1]。豬病毒性腹瀉病主要表現(xiàn)為病豬體溫正常或稍高、精神沉郁、食欲減退或廢絕，常常導致豬群生長發(fā)育遲緩，死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經濟損失，嚴重阻礙畜牧行業(yè)發(fā)展。因此，了解仔豬病毒性腹瀉病的流行局勢，有助于更有效的施行防治措施。

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和豬輪狀病毒(porcine rotavirus，RV)是引起豬病毒性腹瀉的3種主要病原，均具有較強的傳染性，哺乳仔豬的易感性最強，致死率高[2]。3種病毒皆為接觸性傳播，在致病性和流行病學上極為相似，皆以嘔吐、腹瀉、脫水為主要特征，臨床上不易分辨。

近年來，PEDV在我國多個省(市、區(qū))的發(fā)病率呈上升趨勢，是困擾養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。2011年張世忠等對福建省各個地區(qū)的規(guī)?；B(yǎng)豬的頑固性腹瀉病例進行檢測，PEDV感染率高達52.2%[3]。然而，部分病例存在2種或3種病毒混合感染的情況，對養(yǎng)豬業(yè)的潛在危害不容忽視。因此，本研究將2014年1月至2016年12月期間送至龍巖學院動物醫(yī)學研究所的135例疑似患有病毒性腹瀉仔豬的組織樣品采用RT-PCR進行診斷，分析閩西地區(qū)豬病毒性腹瀉的流行狀況，以期為病毒性腹瀉的防控提供資料依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

收集2014年1月至2016年12月福建龍巖及周邊地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場送往龍巖學院動物醫(yī)學研究所進行診斷，患有腹瀉的仔豬腸道組織及內容物，共計135份。

1.2 主要試劑

DL 2000 Marker、總RNA提取液(TaKaRa RNAiso Reagent)、病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa miniBEST Viral DNA/RNA extraction Kit Ver.3.0)、AMV反轉錄酶、rTaqDNA聚合酶、Oligo(dT)、dNTP、DNA Marker DL 2000、RNA酶抑制劑、pMD19-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒(DNA Gel extraction Kit)及質粒提取試劑盒(Plasmid Miniprep Kit)購自愛思進生物技術有限公司產品；感受態(tài)細胞制備試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；三氯甲烷、異丙醇采用分析純試劑。

1.3 引物設計與合成

參考GenBank上發(fā)表的PEDV、TGEV、RV基因序列，使用Premier Premier 5.0生物軟件設計合成特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物詳情見表1。

表1 引物序列

1.4 一步法RT-PCR

按照病毒RNA/DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0)提供的操作手冊，自小腸組織及內容物中提取總RNA并作為模板，進行PCR擴增。PCR反應程序：45 ℃作用30 min，94 ℃預變性5 min；94 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35 次；72 ℃延伸10 min。產物經電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下記錄結果。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

產物經凝膠電泳鑒定，結果獲得與預期大小相同的片段(圖1)。將純化后的PCR產物連接到pMD19-T載體，轉化入DH5α感受態(tài)細胞，涂板過夜，挑取單個菌落，提取質粒，將陽性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，序列結果正確。

2.2 PEDV、TGEV和RV的感染情況統(tǒng)計

對PEDV、TGEV和RV的感染情況進行統(tǒng)計顯示，PEDV的檢出率最高，達到30.37%，而TGEV和RV的檢出率分別為13.33%和11.11%(表2)。

表2 PEDV、TGEV和RV的感染情況

2.3 PEDV、TGEV和RV感染的季節(jié)性分布

3種病毒全年均被檢出，PEDV和RV在冬季感染率較高，陽性檢出率分別達到45.95%和16.22%，TGEV在春季的感染率相對其他季節(jié)較高，其陽性檢出率為17.65%(表3)。

表3 各季節(jié)仔豬腹瀉病毒陽性檢出率統(tǒng)計結果

2.4 PEDV、TGEV和RV年份分布

對各年份陽性檢出率進行統(tǒng)計，結果顯示，PEDV的陽性檢出率在2015—2016年間有所下降，仔豬流行性腹瀉病的流行有所減緩；TGEV陽性檢出率從2014—2015年期間有明顯下降，至2016年又出現(xiàn)小幅提升；RV的陽性檢出率變化不明顯，波動平緩(表4)。

表4 各年份陽性檢出率統(tǒng)計

3 討論與結論

本研究自2014年1月至2016年12月對閩西地區(qū)部分規(guī)?；i場中疑似患有病毒性腹瀉疾病的樣品進行診斷，數(shù)據(jù)統(tǒng)計得出，閩西地區(qū)PEDV、TGEV、RV的陽性檢出率依次為30.37%、13.33%和11.11%；PEDV和RV混合感染、TGEV和RV混合感染、PEDV和TGEV混合感染和3種病毒均被感染的陽性檢出率分別為3.70%、2.22%、0.74%和 0.74%，與我國其他地區(qū)檢出率相近[4-5]。已有報道指出，在2012—2013年期間，閩西地區(qū)PEDV、TGEV、RV的陽性檢出率分別為22.9%、25.0%、14.6%[6]。對比本研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TGEV和RV的陽性檢出率有所降低，PEDV的感染率有一定升高，3種病毒混合感染的比例有所降低。同時，相比全國近年來豬感染腹瀉病毒的流行情況，閩西地區(qū)的TGEV、RV的陽性率均處于較低水平，而PEDV的陽性率仍然高于部分省(市、區(qū))，應當加強防控[7-8]。

本研究中3種腹瀉病毒在1年中均被檢出，其中PEDV在冬季檢出率最高，為45.95%。春、夏和秋季的檢出率分別為26.47%、20.00%、2.00%，冬、春2季PEDV的檢出率明顯高于夏、秋2季，這一結果與PEDV在寒冷季節(jié)尤其在冬春季多發(fā)的流行特點相吻合，與我國部分地區(qū)的檢出情況相似，說明寒冷季節(jié)有利于PEDV的感染與傳播[9]。RV在春、夏、秋季的檢出率分別為7.35%、13.33%、13.33%，在冬季檢出率最高，達到16.22%，與往年閩西地區(qū)檢出情況相比，RV在冬季的檢出率呈現(xiàn)出上升趨勢，而在春、夏、秋季，RV的感染情況沒有明顯變化。TGEV的檢出率與全國大部分地區(qū)的情況相近，與2012—2013年閩西地區(qū)TGEV感染情況相比，檢出率有所下降[6]。通過對不同年份陽性檢出率統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，閩西地區(qū)PEDV感染率在近些年呈現(xiàn)下降趨勢，感染情況有所好轉。TGEV在2015年后感染率下降顯著，并保持較為穩(wěn)定的感染情況。而RV的感染率總體波動不大，這也與我國部分省(市、區(qū))RV感染情況相近。

本研究顯示，當前閩西地區(qū)以PEDV最為流行，對養(yǎng)殖業(yè)影響較大，造成經濟損失更為嚴重，應當受到高度重視。同時，TGEV和RV的感染率雖然相對較低，仍然應當加強防控，不可掉以輕心。因此，在養(yǎng)殖中應當加強預防力度，通過合理使用藥物提高豬群抵抗力，做好免疫接種[10]。從流行特點來看，病毒的流行與季節(jié)氣候有一定聯(lián)系，一般在冬、春季較寒冷潮濕的時期多發(fā)。冬、春季節(jié)由于氣候多變，濕度大，作為傳染源的糞便、乳汁和呼出的氣體等在潮濕的環(huán)境下更容易傳播病毒，攜帶病毒的傳染源污染環(huán)境、飼料、飲水和用具，轉而傳入易感群體的消化道和呼吸道[11]。因此，冬春2季更要謹防病毒的滋生，減少應激，提高飼料營養(yǎng)，改善飼養(yǎng)管理，嚴格維持舍內干燥清潔，定期消毒通風。同時，應適當調整豬舍密度，以便降低傳播速度，對于哺乳仔豬更應加強護理。