楊星雅 田野 馮葆欣 李鵬飛 房國梁 李良 于濤

1國家體育總局體育科學研究所（北京100061）

2國家體育總局體育文化發(fā)展中心

在哺乳動物體內，主要存在著兩種脂肪組織：白色脂肪組織（White adipose tissue，WAT）和棕色脂肪組織（Brown adipose tissue，BAT），共同維持機體能量代謝平衡。WAT是一種儲能組織，以甘油三酯的形式儲存能量。而BAT是一種耗能組織，可以通過產熱的方式將能量消耗。一直以來，BAT在成人體內被認為是低功能的，而且由于數量少和分布局限，對人體代謝的作用是微不足道的[1]。但是近些年來的研究證明，在成人體內也存在著具有活性的棕色脂肪組織[2-4]，因此棕色脂肪組織可能對飲食導致的肥胖、胰島素抵抗以及2型糖尿病等起到重要的預防作用。

BAT是一個強產熱器官，其產熱能力是肝臟的數十倍，也是肌肉的數倍[5]，它具有很強的適應外部刺激的能力，并通過非顫栗性產熱的形式釋放熱量。刺激其產熱的因素包括寒冷、交感神經及細胞分泌因子等[6，7]。產熱機制主要是通過其線粒體內膜上的解偶聯蛋白 1（uncoupling protein 1，UCP1），將脂肪酸氧化和ATP產生解耦連，使能量以熱量形式散失，所以，UCP1是反映其產熱能力的重要指標。PR結構域家族第16個成員（PR-domain-containing 16，PRDM16）是一種鋅指蛋白，在棕色脂肪組織分化過程中起著正向調控作用，能促進棕色脂肪組織的形成，在棕色-白色脂肪組織形成過程中起“開關”的作用，即它可以促進棕色脂肪細胞中一些活性蛋白的特異性基因表達，并抑制白色脂肪細胞中一些活性蛋白的特異性基因表達[8]。過氧化物酶體增殖活化受體γ輔激活因子-1α（PPAR gamma coactivator-1α，PGC-1α）作為轉錄協同因子參與包括調節(jié)棕色脂肪組織產熱等調控能量代謝相關的多種功能[9]，并可與PRDM16相互作用而促進線粒體生成和適應性產熱基因的表達[10]。

運動作為科學有效的減肥方法，對BAT有著怎樣的影響吸引了很多研究人員的興趣。早在上世紀末就有學者對運動對棕色脂肪組織功能的影響開展了研究，但是研究結果并不一致。有研究認為，運動可以增加BAT前體細胞的募集，使UCP1表達增加，增強棕色脂肪組織的產熱作用[11，12]；也有研究發(fā)現，長期的跑臺訓練可以顯著降低大鼠棕色脂肪組織含量和UCP1的表達水平[13-15]；另外，還有學者認為，8周或9周的遞增負荷跑臺訓練對大鼠棕色脂肪組織細胞UCP1 mRNA的表達水平無明顯影響[16，17]。以上這些研究中，運動方案基本都是有氧運動，對于其他運動方式，如抗阻訓練對棕色脂肪組織會產生怎樣影響的研究較少，尤其在國內尚未見相關報道。2012年有研究顯示，抗阻運動可以促進PGC-1α的亞型顯著升高[18]，而PGC-1α可以促進棕色脂肪組織的活性，所以本研究主要從不同運動方式對棕色脂肪組織的影響這一點切入，建立大鼠的抗阻訓練模型，對爬梯法抗阻訓練以及跑臺有氧訓練對大鼠棕色脂肪組織的形態(tài)及活性的影響進行研究。

1 材料和方法

1.1 動物類型

6周齡雄性SD大鼠（購自北京維通利華實驗動物技術有限公司）30只，隨機分為3組，每組10只，分別是安靜對照組（C組）、有氧訓練組（T組）和抗阻訓練組（L組）。自由飲水進食，光照比為12 h∶12 h。適應性飼養(yǎng)1周后稱重，開始進行為期8周的訓練。

1.2 訓練方案

1.2.1 抗阻訓練方案（負重爬梯法）[[1919--2222]]

爬梯1.1×0.18 m，80°傾斜放置，頂部有一個小籠子供大鼠休息，負重裝置固定于大鼠尾部。適應性訓練：共3天，每天不加負荷讓大鼠完成爬梯8次。正式訓練：每輪訓練包含4～8次的遞增負荷爬梯訓練。初始負荷為大鼠體重的50%，然后每次遞增負荷30 g，直到大鼠成功爬梯8次或爬梯失敗后停止本次訓練，大鼠能夠成功完成爬梯的最大負荷認為是本輪訓練的最大負荷。下輪的訓練開始先進行4次爬梯，負荷分別為前次最大負荷的50%、75%、90%和100%，如果大鼠能夠完成這4次訓練，在隨后的爬梯訓練中，每次遞增負荷30 g，直到大鼠完成8次爬梯訓練或爬梯失敗后停止訓練，同樣以成功完成爬梯的最大負荷作為新的最大負荷，依次類推。同一只大鼠兩次爬梯之間休息2 min?？棺栌柧毭?天進行1次，每只大鼠每次訓練時間約為10～20 min，共進行8周。

1.2.2 有氧訓練方案（跑臺法）[[2222--2424]]

適應性訓練：大鼠先進行1周的適應性訓練，以減少正式訓練時的壓力，速度為10 m/min，每天訓練10 min，連續(xù)適應訓練5天。正式訓練：第1周速度為15 m/min，訓練20 min；然后在8周時間里，訓練速度增至28 m/min，訓練時間增至60 min；整個訓練過程跑臺坡度均為0°；每周一至周五訓練，休息2天。

1.2.3 取材

選取各組中訓練情況較好的8只大鼠，在最后一次訓練結束48 h后將大鼠稱重，10%的水合氯醛溶液腹腔麻醉，取肩胛下棕色脂肪組織，稱重并記錄后做好標記，取出一部分放入多聚甲醛中固定，其他組織立即放入液氮中迅速冷凍，然后放－80℃保存。

1.3 實驗分析

1.3.1 形態(tài)學研究

取用多聚甲醛固定的組織，石蠟包埋切片，經HE染色，光鏡下進行形態(tài)學檢查，用imageJ軟件對脂滴面積進行計算，在一個視野內取十個完整脂滴計算其平均面積。

1.3.2 熒光定量PCRPCR實驗

取適量組織，放入預冷的玻璃勻漿器中，按照動物組織總RNA提取試劑盒（天根）說明提取總RNA，然后用反轉錄試劑盒（Takara）將RNA反轉錄成cDNA，然后利用從NCBI數據庫中查找的相關基因的基因序列設計特異性引物（表1），進行SYBR GREEN法熒光定量PCR實驗（Takara）。最后根據各反應孔的Ct值，用相對定量法算出各目的基因的相對表達量。

表1 目的基因的引物序列

1.3.3 WWestern bblloott實驗

預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑。在蛋白抽提開始前加入0.1 M PMSF母液，PMSF終濃度1 mM。稱取適量組織，以裂解液體積=1∶9比例加入裂解液，電動組織勻漿器15000 rpm轉速進行勻漿，每次10 s，間隔10 s，進行3次勻漿。勻漿時EP管需要浸入冰水混合物中進行降溫。勻漿完成后在冰上孵育20 min，4℃離心，13000 rpm，20 min。離心完成后取上清，在上清液中加入5×的蛋白上樣緩沖液，放入煮沸10 min。SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉至NC膜上，3%BSA-TBST封閉30 min，然后將膜與稀釋好的一抗4℃孵育過夜（以β-tubulin作為內參。一抗均購自abcam公司，UCP1、PRDM16和PGC-1α抗體貨號分別為ab10983、ab106410和ab54481，均為兔多克隆抗體，稀釋倍數分別為1∶4000、1∶1000和1∶4000，內參抗體β-tubulin鼠單抗購自Immunoway公司，貨號為YM3030，稀釋倍數為1∶5000），次日TBST洗膜3次，每次5 min，洗去未結合的一抗，加二抗室溫孵育1 h（二抗為山羊抗兔IgG，購自天德悅公司，稀釋倍數為1∶10000），然后TBST洗膜6次，每次3 min，以洗去未結合的二抗，最后ECL加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光：10 s～5 min（曝光時間隨不同光強度而調整），顯影2 min，定影，使用ImageJ軟件獲取條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計方法

所有數據用SPSS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各指標數據以（均數±標準差）表示，三組間比較用單因素方差分析，兩組數據比較用獨立樣本t檢驗，取P＜0.05作為有顯著性差異判斷標準。

2 結果

2.1 兩種運動對大鼠體重的影響

訓練前和訓練后分別將大鼠稱重，訓練前三組大鼠的平均體重分別是：337.4±13.53 g，342.3±14.43 g，345.5±14.98 g，組間無顯著性差異。將訓練后體重減去訓練前體重得出每只大鼠在8周時間里的體重增加量，對照組、有氧訓練組和抗阻訓練組的平均體重增加量分別是201±72 g，105±41 g和140±39 g，有氧訓練后大鼠體重增量僅是對照組的52%，統(tǒng)計學檢驗有顯著性差異（P＜0.01），抗阻訓練后大鼠體重增量為對照組的70%（P＜0.05）。（圖1）

2.2 兩種運動對棕色脂肪組織重量的影響

訓練后取肩胛下棕色脂肪組織稱重，對照組、有氧訓練組和抗阻訓練組的脂肪組織重量分別是：0.39±0.14 g、0.28 ± 0.08 g、0.33 ± 0.10 g。兩個訓練組分別與對照組相比較均無顯著性差異。

2.3 兩種運動對棕色脂肪組織形態(tài)的影響

有氧訓練后BAT的脂滴面積（158 ±52 μm2）與對照組（354±96 μm2）相比明顯變小，且具有顯著性差異（P＜0.01）；抗阻運動后脂滴面積（272 ±86 μm2）與對照組相比有所降低，但無顯著性差異（P＞0.05）。（圖2）

圖1 各組大鼠體重增長量比較

圖2 各組大鼠BAT脂滴面積比較

2.4 兩種運動對BATBAT相關基因mRNAmRNA水平的影響

有氧訓練后PRDM16的mRNA水平是對照組的1.78倍，并有顯著性差異（P＜0.05），而抗阻訓練后是對照組的1.30倍，無顯著性差異；有氧訓練后PGC-1α的mRNA水平是對照組的2.24倍（P＜0.05），抗阻訓練后是對照組的1.25倍（P＞0.05）；有氧訓練和抗阻訓練后UCP1的mRNA水平分別是對照組的1.33倍和1.21倍，二者均無顯著性差異。有氧訓練后BAT相關基因的mRNA表達量有比較明顯的升高，且高于抗阻訓練。（圖3）

圖3 各組大鼠PRDM16、PGC-1α和UCP1 mRNA水平比較

2.5 兩種運動對BAT相關蛋白水平的影響

有氧訓練和抗阻訓練后PRDM16蛋白的表達分別是對照組的1.46倍（P＜0.05）和1.08倍（P＞0.05），PGC-1α蛋白的表達量分別是對照組的1.56倍（P＜0.05）和0.94倍（P＞0.05），UCP1蛋白的表達量分別是對照組的和1.20倍（P＞0.05）和1.02倍（P＞0.05），結果顯示有氧訓練后PRDM16和PGC-1α蛋白顯著上升，而UCP1蛋白有所上升，但是沒有統(tǒng)計學差異，而抗阻訓練后三種蛋白均無顯著性差異。（圖4）

圖4 各組大鼠PRDM16、PGC-1α和UCP1蛋白表達比較

3 討論

本研究對不同運動方式對大鼠BAT的形態(tài)和活性的影響進行了初步探索，除了對目前有文獻報道的有氧運動對棕色脂肪的作用進行了驗證之外，對抗阻運動對棕色脂肪組織的影響進行了研究，并得出了初步的結論。

3.1 有氧運動和抗阻運動對BATBAT的組織形態(tài)的影響

BAT主要由棕色脂肪細胞和細胞周圍豐富的毛細血管和神經構成，含有大量的線粒體。其細胞形態(tài)與WAT僅含一個大脂滴并填充大部分胞質不同，BAT細胞含有多個脂滴，并且胞質內含有很多細胞器[25]。De Matteis[11]的研究表明，6周的有氧運動可極顯著地減小BAT的脂滴面積。本研究中，有氧運動后BAT的脂滴面積也有顯著減小，與前人研究結果較為一致。而抗阻運動后脂滴面積減小不明顯。

3.2 有氧運動和抗阻運動對BATBAT的分化形成的影響

研究證明，經典BAT內細胞的起源與WAT細胞的起源并不相同，反而是與肌細胞的起源相同[26]。Seale等[8]通過實驗發(fā)現，PRDM16是BAT和骨骼肌之間相互轉化的“開關”，而且PRDM16還可以促進一些活性蛋白，如PPARγ、Cidea等在BAT中的高表達，抑制WAT相關活性蛋白如抵抗素（resisitin）等的表達[27，28]。另外，Uldry等[29]研究發(fā)現PRDM16基因的表達會誘導線粒體的生物合成和解偶聯呼吸作用。所以，PRDM16在BAT細胞的發(fā)育過程中起著正向調控作用。

Xu等[12，33]的研究中，8周跑臺運動（15 m/min，40 min/天，1周訓練5天）可以使BAT中的脂肪前體細胞顯著增加，分化正調控因子PRDM16顯著升高，證明有氧運動對棕色脂肪細胞的分化形成有促進作用，這與本研究中結果較一致。而抗阻訓練之后，PRDM16的基因水平和蛋白水平都有一定程度的升高，但不具有顯著性差異。這表明有氧運動對棕色脂肪組織分化過程中的正調控因子有明顯的促進作用，而抗阻運動的影響較小。

3.3 有氧運動和抗阻運動對BATBAT活性的影響

BAT的活性主要分兩個方面——代謝活性和產熱活性。脂肪組織本身作為一種分泌器官，在機體代謝中起著重要作用，PGC-1α是一種轉錄輔激活物，控制著氧化代謝相關基因的表達和線粒體的生物合成，并通過對解偶聯蛋白的誘導和核呼吸因素的調節(jié)而影響氧化呼吸的作用，對BAT的代謝活性有著重要的調控作用，還可協同UCP1發(fā)生產熱作用[30]；UCP1則與BAT的產熱活性密切相關，UCP1在線粒體氧化呼吸的電子傳遞和三磷酸腺苷產生的過程中起解偶聯作用，使脂質氧化產生大量能量以熱能形式經血管輸送到身體各個部位散發(fā)出去[31，32]，從而增加機體的總能量消耗。

研究發(fā)現，相對于安靜對照組，8周跑臺訓練（15 m/min，40 min/天，1周訓練5天）可以使BAT相關基因UCP1、PGC-1α等顯著升高[12，33]，De Matteis[11]的研究發(fā)現，6周跑臺訓練（5次/周，60 min/次，速度18 m/min）可以使BAT中PGC-1α顯著升高，而未影響UCP1的表達，這與本研究的結果比較一致。而抗阻訓練之后，PGC-1α和UCP1的mRNA和蛋白水平都未出現顯著性升高，這表明了有氧運動對棕色脂肪組織的代謝功能有明顯的促進作用，并且對產熱作用影響較小，而抗阻運動對BAT的代謝以及產熱活性的影響都比較小。

本研究中的抗阻訓練方案是參考其他領域研究所確定的，所以本研究中抗阻運動對BAT作用的研究結果存在著一定的局限性，僅僅是作為初步的探索，將來需對不同的運動方案進行探索，可能會出現不同的結果。

4 結論

8周的有氧跑臺運動對BAT的組織形態(tài)、形成和代謝活性有顯著的促進作用，對產熱活性的促進作用較?。欢?周的抗阻運動對BAT無顯著影響。