李世根 樊向華

參芪補虛合劑是由黨參、黃芪、澤蘭、炙甘草、當(dāng)歸等藥材組成，具有益氣養(yǎng)血補虛、化瘀生新的功效，用于治療婦女產(chǎn)后氣血虧虛，夾有淤血阻滯所致頭暈，神疲乏力，小腹隱痛等癥。原方湯劑內(nèi)服具有良好的臨床療效，但湯劑存在服用量大、味苦、攜帶不便、不宜大量制備等缺點。擬將本方改進制成合劑，具有使用方便、療效佳、口感好、制備方法簡單等優(yōu)點，同時保持了湯劑原有的療效。通過對文獻資料的查閱研究，確定本方中與功效主治相關(guān)的成分主要為揮發(fā)油和水提液，結(jié)合臨床應(yīng)用現(xiàn)狀、中藥制劑技術(shù)及生產(chǎn)設(shè)備條件，本實驗對揮發(fā)油提取工藝、水提工藝、濃縮工藝、成型工藝等進行了研究，最終確定參芪補虛合劑的最佳制備工藝，為該制劑的生產(chǎn)、臨床使用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀；Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器；DZTW型電子調(diào)溫電熱套(邦西儀器科技有限公司)；KW-1000DC HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)；Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；Mettler-Toledo XS205DU型電子分析天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與試藥

黨參、黃芪、當(dāng)歸等藥材均購自廣東康圣藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定，均符合《中國藥典》2015年版一部相關(guān)項下要求，黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號分別為110781-200713、111920-201102)均購自中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取

經(jīng)預(yù)試，當(dāng)歸等含油藥材所得揮發(fā)油比重<1.0，故參照《中國藥典》2015年版四部2204項下?lián)]發(fā)油測定法甲法提取揮發(fā)油。以揮發(fā)油提取率為考察指標(biāo)，采用單因素試驗法考察浸泡時間、加水倍數(shù)和提取時間對揮發(fā)油提取工藝的影響。

2.1.1 浸泡時間考察 按處方比例，稱取當(dāng)歸等含油藥材3份，每份383 g，加入8倍量水，分別浸泡0、1、2 h，蒸餾提取8 h，測定揮發(fā)油提取量并計算其提取率，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：浸泡時間對揮發(fā)油的提取無明顯影響，故提取揮發(fā)油時無需浸泡。

表1 浸泡時間對揮發(fā)油提取的影響

2.1.2 加水倍數(shù)考察 按處方比例，稱取當(dāng)歸等含油藥材4份，每份383 g，分別加入6、8、10、12倍量水，蒸餾提取8 h，測定揮發(fā)油提取量并計算其提取率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：當(dāng)加水倍數(shù)達8倍量后，揮發(fā)油提取量隨著加水倍數(shù)的增加變化不明顯，因此加水倍數(shù)確定為8倍。

表2 加水倍數(shù)對揮發(fā)油提取的影響

2.1.3 提取時間考察 按處方比例，稱取當(dāng)歸等含油藥材3份，每份383 g，分別加入8倍量水，提取揮發(fā)油，記錄不同時間揮發(fā)油的累積提取量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：當(dāng)提取時間達6 h時，揮發(fā)油已基本提取完全，因此提取時間確定為6 h。

表3 提取時間對揮發(fā)油提取的影響

2.1.4 揮發(fā)油提取工藝驗證試驗 按處方比例，稱取當(dāng)歸等含油藥材3份，每份383 g，分別加入8倍量水，蒸餾提取6 h，測定揮發(fā)油提取量并計算其提取率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明：揮發(fā)油的平均提取率為0.137%，與單因素試驗的結(jié)果相近，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

2.2 干膏率的測定

精密吸取各樣品濃縮液50 mL，置干燥的蒸發(fā)皿中，照浸出物測定法(《中國藥典》2015年版四部中藥浸出物測定法)測定，稱定干膏重量，并計算干膏率。計算公式：干膏率(%)=(W1×250)/(50×W2)×100% 。 注：W1為50 mL濃縮液中干膏重量，W2為藥材重量。

2.3 指標(biāo)成分的含量測定

2.3.1 色譜條件 黃芪甲苷：AichromBond-SB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-水(32 ∶68)；柱溫35 ℃；流速1.0 mL·min-1；ELSD蒸發(fā)光散射檢測器檢測，氮氣流速1.5 L·min-1，漂移管溫度40 ℃。毛蕊異黃酮葡萄糖苷：Waters Xbridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.2%甲酸(11 ∶89)；柱溫25 ℃；流速1 mL·min-1；檢測波長260 nm。色譜圖見圖1。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品適量，加甲醇分別制成濃度為52.192 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液和0.503 3 mg·mL-1的黃芪甲苷對照品溶液，搖勻即得。

2.3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品溶液1、2、3、5、6、7 μL和黃芪甲苷對照品溶液2、4、6、12、16、20 μL，按照上述色譜條件進樣，測得峰面積。毛蕊異黃酮葡萄糖苷以進樣量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=3.242 7X-49.723，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在52.192～365.34 ng之間線性關(guān)系良好。黃芪甲苷以進樣量的對數(shù)值(X)為橫坐標(biāo)，峰面積對數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程Y=1.624 7X+4.755 3，r=0.999 5，表明黃芪甲苷進樣量在1.006 6～10.06 6 μg范圍內(nèi)自然對數(shù)值與峰面積自然對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 供試品溶液的制備 精密移取各提取濃縮液1 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)15 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，取續(xù)濾液過微孔濾膜，即得毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品溶液。精密移取各提取濃縮液25 mL，照2015版《中國藥典》一部黃芪項下供試品的制備方法制備最終轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得黃芪甲苷供試品溶液。

注：A，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品；B，毛蕊異黃酮葡萄糖苷陰性樣品；C，毛蕊異黃酮葡萄糖苷供試品；D，黃芪甲苷對照品；E，黃芪甲苷陰性樣品；F，黃芪甲苷供試品

圖1參芪補虛合劑高效液相色譜圖

2.3.5 陰性樣品溶液的制備 按處方比例，稱取除黃芪藥材外的各味藥材，分別加8倍水，煎煮2次，每次2 h，常壓濃縮至約250 mL，按2.3.4項下方法制備陰性對照溶液。

2.4 水提工藝優(yōu)選

選擇加水量、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量和干膏率的綜合評分值為指標(biāo)，加權(quán)系數(shù)分別為0.3、0.3、0.4。按處方比例稱取黨參、黃芪、白術(shù)等藥材9份，每份484 g，按L9(34)正交表進行提取，濾過，濾液合并，常壓濃縮并定容至250 mL。試驗安排及結(jié)果見表5，方差分析見表6。由直觀分析可知，各因素對水提工藝的影響順序為提取次數(shù)(C)>加水量(A)>提取時間(B)，因素C(提取次數(shù))對試驗結(jié)果有顯著的影響，因素A(加水量)有一定影響，因素B(提取時間)對試驗結(jié)果無明顯影響。綜合考慮，確定最佳的工藝條件為：藥材加8倍量水提取兩次，第一次提取1.5 h，第二次提取1 h。

2.5 驗證試驗

按處方比例稱取黨參、黃芪、白術(shù)等藥材，每份484 g。當(dāng)歸等提油藥材加8倍量水，加熱回流提取6 h，收集揮發(fā)油，藥液保留，藥渣與黨參等其他藥材按最佳工藝條件進行提取，濾過，濾液與提油的藥液合并，濃縮并定容至250 mL。計算干膏率、黃芪甲苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及綜合評分值。結(jié)果見表7。結(jié)果表明驗證試驗的平均綜合評分值為90.54，與正交試驗綜合評分值最大值相差不大，表明優(yōu)選的工藝參數(shù)穩(wěn)定可行。

表5 參芪補虛合劑水提工藝正交試驗結(jié)果

表6 方差分析表

表7 最佳提取工藝驗證結(jié)果

2.6 濃縮工藝考察

準(zhǔn)確量取按提取驗證工藝條件制備的提取液4份(黃芪甲苷含量為1.72 μg·g-1，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為6.51 μg·g-1)，每份10 kg，2份置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓濃縮(濃縮條件為：-0.085 Mpa; 55～75 ℃)至相對密度為1.10，另外2份常壓濃縮至相對密度為1.10，測定濃縮液的重量及黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，并計算濃縮過程黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留率。結(jié)果見表8。結(jié)果表明提取液采用常壓濃縮或減壓濃縮，其黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的總含量和保留率差別不大，因此生產(chǎn)中可根據(jù)實際情況選用常壓濃縮或減壓濃縮。

表8 濃縮工藝研究結(jié)果

2.7 成型工藝考察

2.7.1 增溶劑的用量考察 揮發(fā)油不溶于水，制備中需加入適量的增溶劑使其能均勻分散在藥液中，聚山梨酯80是常用的增溶劑，是藥典中收載的可作為增溶劑和乳化劑的藥用輔料，其HLB值為15，具有無毒、無刺激性的特點。因此，本品選擇聚山梨酯80作為增溶劑。試驗取含揮發(fā)油的蒸餾液100 mL，攪拌下逐步加入聚山梨酯80，直至上部揮發(fā)油滴均勻分散為止，結(jié)果折算成制劑每1 000 mL中，加入聚山梨酯80的量為5.3 g。

2.7.2 抑菌劑的使用 為保證合劑的穩(wěn)定性，防止微生物生長，應(yīng)加適量的抑菌劑，本品藥液pH值在為5.12，因羥苯乙酯在酸性溶液中防腐作用強，選擇羥苯乙酯作為抑菌劑，參照《中國藥典》2015版四部0181合劑項下防腐劑的用量要求，確定本品一個制劑單位中羥苯乙酯用量為0.5 g。

2.7.3 矯味劑的使用 本方制成合劑后口感有酸澀，且有苦味，需要加入適當(dāng)?shù)奶鹞秳┏C味，以滿足臨床的使用，本品選擇具有藥典標(biāo)準(zhǔn)的蔗糖作為甜味劑。以藥液口感為指標(biāo)，取按優(yōu)選工藝提取的濃縮液900 mL，加入羥苯乙酯0.5 g，加熱保溫30 min，放冷，冷藏靜置24 h，濾過，濾液加入用聚山梨酯80溶解的芳香水溶液100 mL，加純化水至1 000 mL，混勻，逐漸加入蔗糖，觀察藥液外觀并用口嘗之。結(jié)果顯示當(dāng)蔗糖加入量為28 g時，即蔗糖加入量為制成量的2.8%時，合劑味甜，無苦澀味，口感得到改善，確定本品蔗糖用量為2.8%。結(jié)果見表9。

表9 矯味劑用量的考察

3 討論

當(dāng)歸等藥材含有揮發(fā)油，現(xiàn)代藥理研究表明，所含揮發(fā)油具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，還能止痛，促進細(xì)胞的增殖[1-2]，因此，應(yīng)將有效成分揮發(fā)油提取出來。而其他的水溶性成分也具有改善血液循環(huán)、促進造血干細(xì)胞的增殖和分化等作用[3-4]，可用于治療婦女產(chǎn)后氣血虧虛的癥狀，故將提油后的藥渣與其他藥材再進行水煎煮。黨參、黃芪等其他藥材的主要有效成分為水溶性成分[5-6]，故采用水提取。黃芪在本方中起補中益氣的作用。經(jīng)預(yù)試，黃芪中的主要成分黃芪甲苷及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測定方法成熟，且文獻報道中常對其進行含量測定以作為評價指標(biāo)[7-9]，故本方選擇黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量作為提取工藝的監(jiān)測指標(biāo)。

為保證制劑的質(zhì)量和穩(wěn)定，需在制劑中加入適量抑菌劑。pH對抑菌劑的抑菌效力影響很大，常用的抑菌劑苯甲酸鈉防腐能力較強的pH值是在4以下，而羥苯乙酯的適用pH值則相對較廣，因此選擇抑菌劑時要嚴(yán)格考慮藥液的pH值。本實驗對處方藥液的pH值進行監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)藥液的pH值在5左右保持穩(wěn)定，考慮到羥苯乙酯的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，其抑菌效力在酸性溶液中作用最強，而在微堿性環(huán)境中作用減弱，故本制劑選擇羥苯乙酯作用本品的抑菌劑，以防止微生物生長，保證制劑的安全。