覃婷婷，黃哲甦，白海嬌

（天津市藥品檢驗研究院，天津300070）

眼氨肽滴眼液（又名眼寧滴眼液、眼生素滴眼液）系由牛、羊或豬動物眼為原料，經(jīng)乙醇提取等工藝后加適量的抑菌劑并經(jīng)活性炭脫色除雜質(zhì)等工序無菌操作制成的滴眼液。該產(chǎn)品含有多種氨基酸、多肽、核苷酸及鈉、鉀、鈣、鎂等微量元素，用于治療角膜炎、視力疲勞及青少年假性近視［1-2］，臨床上也用于治療角膜上皮持續(xù)性缺損、干眼癥等眼科疾?。?-5］。該產(chǎn)品目前為多劑量滴眼液，需要反復開瓶與空氣接觸，同時本品含有多種氨基酸、核酸、多肽等營養(yǎng)物質(zhì)，容易滋生細菌，故處方中的抑菌劑對于防止微生物繁殖、保證滴眼液的正常使用具有重要意義。

尼泊金酯類（羥苯甲酯、羥苯乙酯和羥苯丙酯等）和醋酸氯己定［6-8］常被作為滴眼液的抑菌劑使用，不同企業(yè)生產(chǎn)的眼氨肽滴眼液中添加了0.01%～0.02%不等的羥苯甲酯、羥苯乙酯和醋酸氯己定。由于不同種類的抑菌劑會對眼晴產(chǎn)生刺激作用進而造成損害［9］，近年來業(yè)界對于滴眼液抑菌劑的質(zhì)量控制日益重視，并對其加入量進行嚴格控制，如《中華人民共和國藥典》（2015年版）二部收載的滴眼液制劑中有11個品種對抑菌劑含量進行控制，限度均應(yīng)為處方標示量的80%～120%或不得過120%，既限制了滴眼液中抑菌劑的添加量，又要保證抑菌劑的抑菌效力。眼氨肽滴眼液質(zhì)量標準收載在國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準第九冊中，現(xiàn)行標準尚未對抑菌劑進行控制，存在著較大的風險隱患。目前尚無文獻報道可以同時測定尼泊金酯類和醋酸氯己定這兩類抑菌劑的檢測方法，因此本研究參考相關(guān)文獻［10-11］建立了眼氨肽滴眼液中抑菌劑的檢測方法，并對市售的2個企業(yè)共5批眼氨肽滴眼液進行了抑菌劑含量測定，并研究活性炭對抑菌劑的吸附作用，為眼氨肽滴眼液的生產(chǎn)改進提供了新的指導依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

羥苯甲酯（批號100278-201705，純度100%）、羥苯乙酯（批號100847-201604，純度99.9%）、醋酸氯己定（批號100183-201604，純度96.3%）（中國食品藥品檢定研究院）；羥苯丙酯（純度99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；活性炭（天津市華東試劑廠）；甲醇為色譜純，三乙胺、磷酸均為市售分析純。眼氨肽滴眼液均為市售制劑，共5批，企業(yè)1為批號160601（S1）和180201（S2），企業(yè) 2為批號161001（S3）、161102（S4）、171004（S5）。

1.2 儀 器

1260液相色譜儀（美國安捷倫公司）；XS 205十萬分之一天平（瑞士梅特勒公司）；SMHS多點加熱磁力攪拌器（韓國大韓科學株式會社）。

2 方法與結(jié)果

2.1 抑菌劑的測定

2.1.1 色譜條件 采用Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，以1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）為流動相A，甲醇為流動相B，梯度洗脫:0～2 min，流動相 B 50%，2～17 min，流動相B 50%→90%，17～20 min，流動相B 90%，20～20.1 min，流動相 B 90%→50%，20.1～27min，流動相B 50%。檢測波長為256 nm，柱溫40℃，流速1.0 mL／min，進樣量20μL。

2.1.2 溶液配制

系統(tǒng)適用性溶液:分別精密稱取羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和醋酸氯己定對照品適量，加50%甲醇溶解并稀釋制成每1 mL分別含20μg的混合溶液作為系統(tǒng)適用性試驗溶液，取該溶液照“2.1.1”項下條件進樣分析，色譜圖見圖1，各組分峰之間分離度均大于1.5。

對照品溶液:取羥苯甲酯和羥苯乙酯分別精密稱定，加50%甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含羥苯甲酯20μg和羥苯乙酯10μg的溶液作為對照品溶液A；取醋酸氯己定精密稱定，加50%甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含醋酸氯己定15μg的溶液作為對照品溶液B。

供試品溶液:取供試品直接進樣分析，以外標法計算抑菌劑含量，色譜圖見圖1。

陰性對照溶液:取未檢出抑菌劑的樣品作為陰性對照溶液，色譜圖見圖1。

Figure 1 Chromatograms of system suitability solution（A），test solution（B）and negative control solution（C）1:Methylparaben；2:Ethylparoben；3:Chlorhexidine acetate；4:Propylparaben

2.1.3 線性關(guān)系 取羥苯甲酯、羥苯乙酯和醋酸氯己定對照品分別精密稱定，用50%甲醇稀釋系列梯度溶液，溶液中分別含羥苯甲酯、羥苯乙酯和醋酸氯己定0.1～80μg／mL搖勻。取上述溶液進樣20μL分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表1。3種抑菌劑在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好線性關(guān)系。2.1.4 精密度、檢出限和定量限 分別取對照品溶液A和對照品溶液B連續(xù)進樣5次，記錄各化合物峰面積，羥苯甲酯、羥苯乙酯和醋酸氯己定的RSD分別為0.43%、0.64%和0.43%；取對照品溶液A和對照品溶液B用50%甲醇稀釋一系列濃度溶液進樣分析，計算各化合物的信噪比，并計算3種抑菌劑的檢出限和定量限，結(jié)果見表1。2.1.5 重復性和回收率 分別取S1和S3的同批樣品各6瓶，照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣分析測定計算各抑菌劑含量及RSD，結(jié)果見表2。取S1和S3各9份樣品，每份分別精密加入相當于樣品中抑菌劑含量80%、100%、120%的對照品，制備低、中、高3種濃度的溶液進樣測定，計算各抑菌劑的平均回收率，結(jié)果見表2。

Table 1 Standard curves，LOQ，LOD of three bacteriostatics（n＝10）

Table 2 Results of repeatability and recovery test

2.1.6 樣品測定 取收集到的5批眼氨肽滴眼液照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣分析測定各抑菌劑含量，結(jié)果見表3。

2.2 活性炭對抑菌劑的吸附試驗

取羥苯甲酯、羥苯乙酯和醋酸氯己定分別精密稱定，加50%甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含羥苯甲酯5 mg、羥苯乙酯2.5 mg和醋酸氯己定3.75 mg的抑菌劑貯備液，精密量取上述抑菌劑貯備液適量置同一量瓶中，加活性炭適量，用不含抑菌劑的供試品S3稀釋制成每1 mL溶液中含羥苯甲酯0.2 mg、羥苯乙酯0.1 mg和醋酸氯己定0.15 mg的抑菌劑溶液進行以下試驗。

Table 3 Bacteriostatic detected in different samples of ocular extractives eye drops

2.2.1 攪拌時間影響試驗 制備活性炭含量為0.2%的抑菌劑溶液分別在室溫、40℃、60℃3個不同溫度下攪拌上述抑菌劑溶液，并分別在15、30、45、60 min取溶液過濾，照“2.1.2”項下方法測定3種抑菌劑的剩余百分含量，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在不同溫度下，羥苯甲酯和羥苯乙酯在15 min時含量均低于初始加樣量的15%，而醋酸氯己定則被完全吸附，15 min后活性炭的吸附作用趨于穩(wěn)定。同時在不同溫度下，活性炭對抑菌劑的吸附存在差異。

Figure 2 Effect of activated carbon on adsorption of methylparaben（A）and ethylparoben（B）under different stirring time（xˉ±s，n＝3）

2.2.2 加熱溫度影響試驗 考慮到眼氨肽滴眼液實際生產(chǎn)時，加活性炭攪拌保溫的時間一般不少于15 min，故選擇30 min作為攪拌停止時間，考察在不同溫度時活性炭對抑菌劑的吸附影響。制備活性炭含量為0.2%的抑菌劑溶液分別在40℃、60℃、80℃3個不同溫度下攪拌上述溶液，并在30 min時取溶液過濾，照“2.1.2”項下方法測定3種抑菌劑的剩余百分含量，結(jié)果在不同溫度下醋酸氯己定均被完全吸附，而對于羥苯甲酯和羥苯乙酯，溫度越低，則抑菌劑剩余量越少，活性炭對抑菌劑的吸附能力越強，見圖3。

2.2.3 活性炭濃度影響試驗 分別制備活性炭含量為0.1%、0.2%、0.3%的抑菌劑溶液。在80℃下攪拌上述溶液，并在30 min時取溶液過濾，照“2.1.2”項下方法測定3種抑菌劑的剩余百分含量，結(jié)果醋酸氯己定仍被完全吸附，羥苯甲酯和羥苯乙酯被部分吸附，剩余百分含量見圖4。由圖4可知，活性炭添加量越多，抑菌劑被吸附的量越多，其中活性炭添加量為0.1%時，抑菌劑剩余量最高。

Figure 3 Effect of activated carbon on the adsorption of bacteriostat at different temperatures（xˉ±s，n＝3）

Figure4 Effect of different amounts of activated carbon on the adsorption of bacteriostat（xˉ±s，n＝3）

2.2.4 抑菌劑劑量影響試驗 分別精密量取“2.2”項下方法抑菌劑貯備液適量，加供試品S3稀釋制得含抑菌劑為處方量的100%、200%、300%的抑菌劑溶液，活性炭添加量均為0.2%。在80℃下攪拌上述溶液，并在30 min時取溶液過濾，照“2.1.2”項下方法測定3種抑菌劑的剩余百分含量，結(jié)果見圖5。由圖5可知，活性炭添加量為0.2%時，當抑菌劑添加量分別增至處方量的200%和300%，剩余的羥苯甲酯和羥苯乙酯才能接近處方量，而即使將抑菌劑添加至處方量的300%，經(jīng)吸附后，醋酸氯己定僅剩下處方量的4.0%，抑菌劑添加量為處方量的100%和200%時，醋酸氯己定剩余量均為0%。

Figure 5 Effect of activated carbon on the adsorption of different concentrations of bacteriostat（xˉ±s，n＝3）

3 討 論

3.1 流動相的選擇

參考文獻［10］試驗流動相為0.02 mol／L磷酸二氫鉀（用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5）-乙腈（70∶30）時，羥苯甲酯與醋酸氯己定同時洗脫，無法有效分離。另參考文獻［11］分別考察了羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯和醋酸氯己定的峰形與分離度，發(fā)現(xiàn)當流動相為1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.0）時醋酸氯己定峰有拖尾現(xiàn)象，而將該流動相用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0時，醋酸氯己定峰對稱性較好。故最終選擇流動相為以1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0）為流動相A，甲醇為流動相B進行梯度洗脫，既保證3種抑菌劑能夠完全分開，又使色譜峰具有良好的對稱性。

3.2 活性炭對抑菌劑的吸附影響

本研究發(fā)現(xiàn)活性炭對羥苯甲酯、羥苯乙酯和醋酸氯己定3種抑菌劑的吸附能力由大到小分別為:醋酸氯己定、羥苯乙酯、羥苯甲酯，與眼氨肽滴眼液樣品抑菌劑測定結(jié)果相一致，即抑菌劑含量由小到大依次為:醋酸氯己定、羥苯乙酯、羥苯甲酯。由此可見，在生產(chǎn)眼氨肽滴眼液時，不適宜在使用活性炭過濾雜質(zhì)前添加尼泊金酯類和醋酸氯己定抑菌劑，該操作將導致抑菌劑被大量吸附，而這一現(xiàn)象在眼氨肽注射液的生產(chǎn)中尚未為人們所認知。此外，本實驗為方便操作，將3種抑菌劑放在同一溶液中進行影響因素試驗，在實際生產(chǎn)中，眼氨肽滴眼液產(chǎn)品只添加一種或者兩種抑菌劑，被活性炭吸附后抑菌劑的剩余量可能會更少。另外，有文獻報道當活性炭濃度為0.5%，在85℃保溫30 min時活性炭去除眼氨肽中的雜蛋白效果最好［12］，然而該條件下，大部分抑菌劑已被活性炭吸附。綜上所述，建議在眼氨肽滴眼液的生產(chǎn)中抑菌劑應(yīng)在活性炭除雜后添加，或者選擇其他對抑菌劑吸附性小、影響小的過濾介質(zhì)或除雜工藝。如必須在添加抑菌劑前使用活性炭吸附除雜，因則應(yīng)綜合考慮活性炭對雜蛋白、主成分和抑菌劑的吸附影響，選擇活性炭吸附率低的抑菌劑或調(diào)整抑菌劑的添加量，并檢測終產(chǎn)品中抑菌劑的含量，使抑菌劑維持合理有效的濃度，保證產(chǎn)品的抑菌效力和質(zhì)量安全。

3.3 眼氨肽滴眼液中抑菌劑的測定結(jié)果

本試驗僅對市售的兩個企業(yè)生產(chǎn)的5批眼氨肽制劑進行了抑菌劑含量測定，其結(jié)果均低于處方量的10%，未達到《中華人民共和國藥典》中其他品種抑菌劑應(yīng)為處方量80%～120%的限度要求，說明這兩個企業(yè)的眼氨肽滴眼液質(zhì)量仍有待提升，同時，應(yīng)進一步建立眼氨肽滴眼液的抑菌劑測定標準，從而保證該品種的產(chǎn)品質(zhì)量。