王小柱

（遼寧省畜產(chǎn)品安全監(jiān)察所，遼寧 沈陽 110003）

草分枝桿菌（Mycobacterium phlei，M.phlei）是一種從牧草中最先分離純化出來的耐酸桿菌，在土壤、植物和飲水中廣泛分布。滅活后的草分枝桿菌對(duì)人畜無致病性，具有抗菌、調(diào)節(jié)腸道微生物平衡、提高免疫力、提高食物消化利用率等功能[1]。分枝桿菌細(xì)胞壁由肽聚糖（PG）、脂多糖（LPS）、磷壁酸（TA）、類脂A相關(guān)蛋白（LAP）、表面相關(guān)物質(zhì)（SAM）等多種活性成分構(gòu)成。肽聚糖是革蘭陽性菌等原核生物細(xì)胞壁特有的組分，可作為真核免疫系統(tǒng)識(shí)別的理想靶位[2-3]。目前，肽聚糖提取分離均采用Sekine建立的雙歧桿菌完整肽聚糖提取法。但該法試驗(yàn)步驟繁瑣，整個(gè)過程需要15 d左右，耗時(shí)長(zhǎng)，得率低。宋曉玲等在試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)了孟凡倫的方法，只用1周時(shí)間即可制得雙歧桿菌的粗提肽聚糖產(chǎn)品[4-5]。此法既節(jié)約時(shí)間又簡(jiǎn)便易行。本試驗(yàn)在此方法上對(duì)超聲破碎輔助提取草分枝桿菌肽聚糖進(jìn)行了初步研究，為草分枝桿菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品領(lǐng)域的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑材料：以實(shí)驗(yàn)室冷藏斜面保存草分枝桿菌為試驗(yàn)材料。

試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、ddH2O、胰蛋白酶、Tris-Hcl（pH=7.5）、乙酸鈉、氯仿、甲醇、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、溶菌酶。

1.2 設(shè)備與儀器GL21M高速冷凍離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F170震蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)生化儀器；UV-2500紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；SCIENTZ-650E超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，浙江新芝生物科技股份有限公司；1260型液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草分枝桿菌的培養(yǎng)

1.3.1.1 菌種活化首先用60℃水浴加熱冷藏的裝有已純化的草分枝桿菌管，10 min后取出，在固體瓊脂培養(yǎng)基板中劃線接種，37℃條件下培養(yǎng)24 h，槍頭挑取單克隆菌落，接種于50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h。

1.3.1.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定取培養(yǎng)好的草分枝桿菌，以2%接種量轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，定時(shí)測(cè)定OD600值，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.1.3 擴(kuò)大培養(yǎng)及菌體收集取單菌落接種于50 mL培養(yǎng)基中，37℃恒溫水浴振蕩箱中振蕩培養(yǎng)，200 r/min，24 h，1%接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，180 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)18 h。離心沉淀收集菌泥，用0.9%生理鹽水反復(fù)洗滌菌泥至乳白色，計(jì)算該菌體濕重。

1.3.2 草分枝桿菌肽聚糖的提取

1.3.2.1 去磷壁酸將上述細(xì)菌沉淀用80 w功率，累計(jì)超聲20 min（超聲3 s，間隔2 s）。隨后將超聲處理的細(xì)胞壁沉淀懸浮在10%三氯乙酸中，37℃條件下水浴15 min，冷卻至室溫。用4 000 r/min，離心18 min收集沉淀，用蒸餾水洗滌3次。

1.3.2.2 去脂質(zhì)將獲得沉淀懸浮于乙酸鈉-氯仿-甲醇的混合液中，體積比為4:5:10。靜止40 min，4 000 r/min離心30 min收集沉淀。

1.3.2.3 去蛋白將上步得到的沉淀加入到含有1 mg/mL胰蛋白酶，0.1 mol/L，pH=7.5的Tris-Hcl緩沖溶液中，37℃水浴12 h，8 000 r/min離心15 min棄去沉淀，冷凍干燥得白色粉末即為肽聚糖。

1.4 生化特性研究

1.4.1 溶菌酶溶解試驗(yàn)參照金盼盼的方法[6]，用磷酸鹽緩沖液（pH=6.2）將提取肽聚糖配成1 mg/mL溶液，加溶菌酶250 μg/mL，在37℃，140 r/min振蕩處理22 h，測(cè)定OD600。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定以考馬斯亮藍(lán)G250為染液，標(biāo)準(zhǔn)參考蛋白BSA，Bradford法測(cè)定粗提肽聚糖物的蛋白含量（%）。

1.4.3 總脂肪含量的測(cè)定分別量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，同時(shí)加入肽聚糖樣品1 mg于另外3支試管中，無水乙醇混至1 mL搖勻。然后分別量取0.2 mL，對(duì)應(yīng)加入濃硫酸1 mL，沸水浴20 min充分水解脂類，冷卻。隨后加入香草醛3 mL，室溫靜置20 min，測(cè)定OD525。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 總糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法。取10支試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，另取3支試管分別加入1 mg肽聚糖樣品，蒸餾水定量至1 mL；再加入1.0 mL 5%的重蒸苯酚溶液和濃硫酸5 mL，立即搖勻。沸水浴25 min，取出后快速冷卻至室溫。分別測(cè)定各管OD490，以葡萄糖含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度OD490為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定總糖含量。

1.5 化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析

1.5.1 紅外光譜分析用溴化鉀（KBr）將肽聚糖提取物壓片，在4 000～370 cm-1范圍內(nèi)用傅里葉變換紅外光譜分析儀掃描分析。

1.5.2 SDS-PAGE分析肽聚糖分子量用pH=6.2的PBS將肽聚糖提取物配成1 mg/mL，加入200 μg/mL的溶菌酶，37℃消化12 h。然后從中取1 mL樣品，3 000 r/min離心除去蛋白質(zhì)，取上清。用5%濃縮膠，12%分離膠進(jìn)行電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果由草分枝桿菌生長(zhǎng)曲線可知，在0～5 h內(nèi)處于初始期，在5～15 h內(nèi)處于對(duì)數(shù)期，在16～20 h時(shí)處于平緩期。在18 h草分枝桿菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期，其生長(zhǎng)量最大，OD值為1.843，活菌數(shù)為7.3×108/mL。

2.2 PG得率計(jì)算草分枝桿菌由10.78 g（細(xì)胞干重）獲得粗制肽聚糖1.43 g，獲得率13.33%。

肽聚糖得率（%）=得到的肽聚糖質(zhì)量/處理的菌體質(zhì)量×100%=1.43 g/10.78 g×100%=13.33%

2.3 組成成分及化學(xué)結(jié)構(gòu)的分析

圖1 草分枝桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Standard curve ofM.phlei.

2.3.1 溶菌酶溶解測(cè)定

表1 PG溶菌酶消化試驗(yàn)Table 1 PG lysozyme digestion experiment

在草分枝桿菌肽聚糖被溶菌酶消化的過程（16 h）中，其吸光度值變化見表1。在8 h內(nèi)，隨水解時(shí)間延長(zhǎng)，溶液吸光值逐步降低。9 h后吸光值趨于平緩，說明該提取物可被溶菌酶消化降解，為肽聚糖。

2.3.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 100 μg/mL BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線如圖2。其回歸方程為y=61.382x+0.0081，決定系數(shù)R2=0.9996（其中x軸為標(biāo)準(zhǔn)蛋白液的濃度，y軸為595 nm處吸光度值），表明檢測(cè)蛋白質(zhì)含量具有較好的線性相關(guān)性。3次測(cè)量取均值得出肽聚糖樣品的平均吸光值是0.255。計(jì)算得知，該樣品蛋白質(zhì)含量為4.02 μg/mL，約占肽聚糖樣品的4.02%。

圖2 牛血清蛋白（BSA）溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of BSA

2.3.3 總脂含量的測(cè)定 0.1 mg/mL膽固醇母液標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線如圖3。其回歸方程為y=0.9967x-0.0207，決定系數(shù)R2=0.9961（其中x軸為標(biāo)準(zhǔn)膽固醇母液的體積，y軸為525 nm處的吸光值），表明檢測(cè)脂肪含量具有良好的線性相關(guān)性。3次測(cè)量取均值得出肽聚糖樣品的平均吸光值是0.0198由回歸方程得，脂肪含量為0.041 mg/mL，由此得出總脂含量為4.1%。

圖3 膽固醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of cholesterol

2.3.4 總糖含量的測(cè)定 100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，如圖4。其回歸方程為y=0.097x-0.2636，決定系數(shù)R2=0.9973（其中x軸為葡萄糖含量，y軸為490 nm處的吸光值），表明檢測(cè)葡萄糖含量具有良好的線性相關(guān)性。3次測(cè)量取均值得出肽聚糖樣品的平均吸光值是0.6375由回歸方程得，總糖含量為38.54 μg/mL，由此得出總糖含量為38.54%。

圖4 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4Standard curve of glucose

2.4 肽聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 紅外光譜分析肽聚糖提取物紅外光譜圖如圖5所示。-OH鍵通常在3 500～3 100 cm-1處有振動(dòng)伸縮；C-H鍵通常在3 000～2 800 cm-1處振動(dòng)伸縮；糖類物質(zhì)在1 400～1 200 cm-1處也出現(xiàn)峰群振動(dòng)伸縮；N-H鍵變角振動(dòng)出現(xiàn)在1 560～1 520 cm-1處；C-O-H鍵伸縮振動(dòng)出現(xiàn)在1 200～1 000 cm-1范圍。在判斷糖苷鍵的類型上，α構(gòu)型吸收峰出現(xiàn)在840 cm-1附近，β型出現(xiàn)在880 cm-1附近[7-8]。根據(jù)圖5，本試驗(yàn)中從草分枝桿菌細(xì)胞壁中提取出的糖為β型肽聚糖。

圖5 肽聚糖提取紅外光譜分析Fig.5 FITR analysis of peptidogly

2.4.2 SDS-PAGE分析結(jié)果電泳結(jié)果如圖6。1為樣品，2為空白。在肽聚糖的電泳試驗(yàn)中，由于其溶解度極低，需先經(jīng)溶菌酶消化降低肽聚糖分子量，然后對(duì)可溶性肽聚糖進(jìn)行電泳。經(jīng)染色后為單一條帶，大小在55～70 ku之間，由此說明本試驗(yàn)分離的肽聚糖分子量約為62 ku。

圖6 肽聚糖提取物SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of peptidoglycan

3 討論

從草分枝桿菌中分離提取細(xì)胞壁的過程中，首先采用了超聲波方法破碎細(xì)胞壁，條件為功率80 w，超聲時(shí)間40 min，處理溫度為25℃。隨后結(jié)合三氯乙酸法從破碎的細(xì)胞壁中提取肽聚糖，大大提升了肽聚糖的得率，與樂軍等的提取結(jié)果大致相同[9-12]。本試驗(yàn)中肽聚糖分離提取得率為13.33%。在提取的肽聚糖中，總糖占38.54%，蛋白質(zhì)占4.02%，總脂含量占4.1%。肽聚糖是N-乙酰胞壁酸二糖單元和β-（1，4）-糖苷鍵連接的N-乙酰葡糖胺以及肽橋與四肽亞單位組成的聚合物。通過對(duì)提純的肽聚糖提取物的化學(xué)成分分析和紅外光譜及高效液相色譜結(jié)構(gòu)質(zhì)鑒定，確定提取物主要成分為肽聚糖。由于肽聚糖不易溶于水，最終采用了先用溶菌酶消化降低其分子量，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳試驗(yàn)，確定出本試驗(yàn)提取肽聚糖分子量約為62 ku。