付保強，虎紅紅，劉麗霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）是動物機體中緊密連鎖的不平衡的基因復(fù)合體[1]，其在機體免疫應(yīng)答、抗原識別和機體調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[2]，編碼產(chǎn)物為MHC抗原分子，與動物機體免疫疾病存在緊密聯(lián)系性[3-6]。Acosta-Rodrguez等[7]于2005年報道了牛MHC并將其命名為牛白細胞抗原系統(tǒng)（Bovine lymphocyte antigen，BoLA）。荷斯坦牛BoLA基因位于牛的23號染色體上，主要是由三類基因組成，分別為Ⅰ類分子、Ⅱ類分子和Ⅲ類分子，其中Ⅱ類分子主要為異源雙體膜糖蛋白，其被劃分為Ⅱa、Ⅱb兩個亞區(qū)，DRA是Ⅱ類分子Ⅱa亞區(qū)的基因，為MHC分子進行編碼，具有高度多態(tài)性[8-11]。由于荷斯坦牛BoLA-DRA能夠引起抗原抗體反應(yīng)降低牛乳房炎等免疫疾病的發(fā)生，使其成為了荷斯坦牛抗病力的良好分子候選基因之一。近年來，研究者對荷斯坦牛BoLA基因的功能、多態(tài)性及其與免疫功能和疾病的相關(guān)性做了大量研究，高樹新（2005）[12]通過對不同牛BoLA基因研究發(fā)現(xiàn)其具有高度多態(tài)性且對奶牛乳房炎具有致病性。王興平（2004）[13]通過對四種黃牛為研究采用PCR-RFLP和SSCP方法，結(jié)合克隆測序分別研究了MHC的DRA基因第二外顯子和DRB3基因第二外顯子的分子遺傳變異，并運用最小二乘線性模型，對所發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點與牛的生產(chǎn)性狀進行了相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與牛的生產(chǎn)性能高度相關(guān)。楚秋霞等（2013）[14]通過運用生物信息學(xué)對南陽牛BoLA-DRA編碼蛋白區(qū)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DRA基因與其他物種核苷酸序列的同源性均在90%以上，進一步表明該基因與疾病性狀存在相互作用關(guān)系。李彥清等（2015）[15]在對牦牛和普通牛BoLA-DRA*Exon2-intron2多態(tài)性分析比較后發(fā)現(xiàn)牦牛DRA基因第2外顯子區(qū)堿基序列與普通牛以及山羊的同源性最高，系統(tǒng)進化情況與它們親緣關(guān)系遠近一致。這些研究都表明BoLA-DRA基因在控制機體免疫調(diào)控方面具有重要作用，但是前人對BoLA-DRA基因大多數(shù)研究主要集中在外顯子2以及其他內(nèi)含子，但是對于荷斯坦牛BoLA-DRA基因中1～93位的外顯子1生物信息學(xué)研究未見報道。

本研究以荷斯坦牛為研究對象，通過構(gòu)建DNA混合池，擴增后對其進行測序的方法對荷斯坦牛Bo-LA-DRA基因外顯子1進行生物信息學(xué)分析，旨在為研究該基因理化特性、結(jié)構(gòu)功能、免疫調(diào)節(jié)機制提供必要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA混合池的構(gòu)建本研究血樣采自寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)有限公司，從300頭處于泌乳期荷斯坦牛中用醫(yī)用采血管尾靜脈采血10 mL，利用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法荷斯坦牛血液總基因組DNA[16]，-20℃保存?zhèn)溆?。?%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取效果，隨機抽取30個效果良好的樣品各取1 μL構(gòu)建DNA混合池。

1.2 引物設(shè)計和PCR擴增測序根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中荷斯坦牛BoLA-DRA基因序列（GenBank:M30120.1），利用在線軟件Primer-BLAST對荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1設(shè)計1對的特異性引物，在BoLA-DRA基因中處在1～93位的外顯子1預(yù)期擴增片段長度為161 bp，引物序列分別為：F1:5'-CACCAAAGAAGAAAA TGGCC-3',R1:5-CCACAGTTCATTTCTCCGAAGC-3'上引物序列設(shè)計好后送至蘇州金唯智生物科技有限公司完成。PCR擴增體系20 mL：DNA模板0.8 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11 μL，ddH2O 7.4 μL。PCR條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57.6℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測，紫外分光光度計檢測。將擴增產(chǎn)物進行回收純化后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行PCR產(chǎn)物測序。

1.3 生物信息學(xué)分析軟件通過對荷斯坦牛BoLADRA基因外顯子1擴增產(chǎn)物的序列測序，運用RNA fold web server在線服務(wù)器（http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預(yù)測mRNA二級結(jié)構(gòu)，運用軟件（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sop ma.html）預(yù)測蛋白質(zhì)的二級，利用Protfun在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）分析預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果荷斯坦?；駼oLA-DRA外顯子1 PCR擴增產(chǎn)物片段大小在160 bp左右，預(yù)期目的片段長度大小相符，且條帶明亮清晰、特異性良好，如圖1所示。2

圖1 荷斯坦?；駼oLA-DRA外顯子1 PCR擴增結(jié)果Fig.1PCR amplification Results of BoLA-DRA exon 1 in Holstein gene

2.2 測序結(jié)果分析通過對荷斯坦牛DRA外顯子1基因進行測序分析發(fā)現(xiàn)，存在1個插入位點（exon1-1T^2）測序峰圖如圖2和3所示。

圖2 荷斯坦牛DRA基因外顯子1測序峰圖Fig.2The sequence peak diagram of exon 1 of DRA gene

2.3 mRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果通過運用在線軟件對荷斯坦牛DRA外顯子1插入位點mRNA二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)外顯子1堿基插入之后自由能與突變前相同，該插入沒有改變DRA外顯子1mRNA的二級結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖3 測序結(jié)果序列與基因庫序列比較圖Fig.3 Comparison chart of sequencing result sequence and gene pool sequence

圖4 荷斯坦牛DRA基因外顯子1 mRNA二級結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Exon 1 mRNA secondary structure of the DRA gene in Holstein

2.4 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測荷斯坦牛DRA外顯子1的插位點為錯義突變，因為外顯子1在DRA基因序列的1～93位，但編碼區(qū)只有15～93位點，插入位點不在編碼區(qū)上，未造成氨基酸改變，突變前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相同，同時也不會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能。預(yù)測結(jié)果顯示，荷斯坦牛DRA外顯子1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋（30.77%）、β-折疊（34.62%）、β-轉(zhuǎn)角（11.54%）、無規(guī)則卷曲（23.08%）組成，其中β-折疊占比例最高。

2.5 蛋白質(zhì)的功能預(yù)測與分析荷斯坦牛DRA外顯子1從預(yù)測結(jié)果可以看出編碼蛋白質(zhì)的荷爾蒙和免疫應(yīng)答的含量相對較高，其幾率分別為21.057和3.546，荷爾蒙的幾率最高，免疫應(yīng)答次之，據(jù)此可以推斷荷斯坦牛DRA基因外顯子1在牛的性激素和免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用。

3 討論

MHC基因是指脊椎動物某一染色體上編碼主要組織相容性抗原、控制細胞間相互識別、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一組連鎖的基因群，其具有高度多態(tài)性，與動物自身免疫疾病存在密切關(guān)系BoLA-DRA基因是奶牛MHC基因中的一個編碼基因，目前國內(nèi)對于BoLA-DRA基因的研究主要集中在DRA基因的多態(tài)性上分析上，蒲蘭屏等（2012）[17]通過運用生物信息學(xué)對比不同牛的基因，發(fā)現(xiàn)與MHC家族其他基因不同DRA基因在所有的動物尤其是反芻動物中表現(xiàn)出高度保守，包括肽結(jié)合部位（PBS）、N-糖原區(qū)、α1、α2區(qū)等功能部位都呈現(xiàn)出高度保守。高樹新等（2008）[18]發(fā)現(xiàn)兩種兼用型在研究DRA外顯子2時發(fā)現(xiàn)在感染乳房炎牛中CC基因型頻率最高，在健康牛中BC基因型頻率最高，結(jié)果表明牛乳房炎抗性和易感性可能與牛的基因型有密切關(guān)系。前人對于外顯子1的研究還未見報道，本研究主要對荷斯坦牛BoLA-DRA外顯子1的擴增產(chǎn)物經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)在第一位堿基C和第二位堿基A之間有堿基T的插入，但是沒有影響mRNA的二級結(jié)構(gòu)的變化，并且在發(fā)生突變前后自由能的大小相同，出現(xiàn)的原因可能是因為此堿基的插入為錯義突變，但因為插入位點不在編碼區(qū)，不會引起氨基酸結(jié)構(gòu)功能以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的變化，所以對于荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1高級結(jié)構(gòu)和功能未發(fā)生變化。功能預(yù)測結(jié)果表明，該基因可能在荷爾蒙的產(chǎn)生和免疫應(yīng)答過程中起著重要的作用，研究結(jié)果可為荷斯坦牛BoLA-DRA基因外顯子1功能的研究提供科學(xué)理論依據(jù)。

表1 荷斯坦牛DRA基因外顯子1蛋白質(zhì)的功能預(yù)測與分析Table 1 Functional prediction and analysis of exon 1 protein in Holstein DRA