齊亞楠，劉文嬌，梅雪昂，馬婧，韓瑞鈺，馬姣英，王樹(shù)松，，*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，石家莊 050017；2.河北師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024；3.河北省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院/國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050071)

肥胖已經(jīng)成為一個(gè)全球性的問(wèn)題。有研究顯示，我國(guó)35～64歲人群肥胖率高達(dá)20.2%，超重率更是超過(guò)了38.8%[1]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)脂肪根據(jù)功能可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織，兩者在肥胖發(fā)生機(jī)制中的作用恰好相反。因此，脂肪細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制一直是肥胖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。PRDM蛋白家族是一類(lèi)具有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白轉(zhuǎn)錄因子，目前在人體組織和細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)了17種[2]。有研究顯示，PRDM16在棕色脂肪形成過(guò)程中起到分子開(kāi)關(guān)的作用，可通過(guò)誘導(dǎo)棕色脂肪形成過(guò)程中基因的表達(dá)，增強(qiáng)線(xiàn)粒體解偶聯(lián)呼吸作用，使機(jī)體多余的能量以熱能的形式散發(fā)，從而抑制肥胖[3-4]。目前，精液常規(guī)分析仍然是衡量男性生育力和精子質(zhì)量的主要指標(biāo)[5]，因此我們同時(shí)對(duì)大鼠精液參數(shù)進(jìn)行了分析。本課題組通過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，鋅相關(guān)蛋白與男性生殖密切相關(guān)(待發(fā)表)，而PRDM16又是與肥胖相關(guān)的鋅指蛋白，因此本研究構(gòu)建了肥胖大鼠模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)鋅指蛋白PRDM16在大鼠睪丸、睪周脂肪中的表達(dá)及在睪丸中的定位，探討鋅指蛋白PRDM16、肥胖和生殖的關(guān)系。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及肥胖動(dòng)物模型的建立：清潔級(jí)雄性SD大鼠20只，平均體重為(103±11)g，購(gòu)買(mǎi)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將20只SD大鼠隨機(jī)分成正常組6只和肥胖組14只；其中正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，肥胖組給予高脂飼料喂養(yǎng)。期間自由進(jìn)食水，標(biāo)準(zhǔn)鼠籠喂養(yǎng)，每籠3只，飼養(yǎng)溫度為20～25℃，每周對(duì)大鼠體重進(jìn)行檢測(cè)。12周末，肥胖組大鼠體質(zhì)量大于正常組平均體質(zhì)量的20%為肥胖模型構(gòu)建成功。最終成功建立肥胖大鼠模型7只。

2.樣品的制備：采用10%的水合氯醛溶液對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，取大鼠睪丸組織和雙側(cè)睪周脂肪稱(chēng)重并記錄，部分睪丸組織放入10%的甲醛溶液中固定，其余立即放入液氮中，最終放置-80℃保存待用。

二、方法

1.HE染色：10%的甲醛固定不同組大鼠睪丸組織，石蠟包埋，切片烤片，常規(guī)脫蠟復(fù)水；蘇木素染色2 min，自來(lái)水沖洗，鹽酸酒精分化3 s，自來(lái)水沖洗后氨水返藍(lán)3 s，自來(lái)水沖洗，伊紅染色30 s；自來(lái)水沖洗后梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封片。

2.免疫組織化學(xué)：10%的甲醛固定不同組大鼠睪丸組織，石蠟包埋，切片烤片，脫蠟復(fù)水；PBS洗滌3次，枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，室溫自然冷卻，洗滌后用3%的過(guò)氧化氫孵育40 min；PBS洗滌3次，山羊血清封閉1 h，滴加抗體PRDM16(PA5-20872，Thermo Fisher，美國(guó))，其中一抗用PBS以1∶100的比例稀釋?zhuān)?℃過(guò)夜；PBS洗滌3次，滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG工作液(SP-9001，北京中杉金橋)室溫孵育1 h；洗滌后加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育30 min，PBS洗滌3次，DAB(北京中杉金橋)顯色，蘇木素復(fù)染、中性樹(shù)膠封片。陽(yáng)性染色為棕黃色。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR：稱(chēng)取不同組大鼠睪丸、睪周脂肪于無(wú)酶微量離心管(EP)管中，用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(ZP404，北京莊盟國(guó)際)提取睪丸及睪周脂肪組織總RNA，并按照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)為cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增PRDM16。

PRDM16引物序列：F 5’-CACAACTTGCTGGTCAAGGC-3’，R 5’-GCAGGTTTGGCCTCTTTTGG-3’；

β-actin引物序列：F 5’-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，R 5’-GATGCCTCTCTTGCTCTGGG-3’。

PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃15 s、63.2℃30 s、72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。以β-actin基因作為內(nèi)參。

分別以正常組大鼠睪丸及睪周脂肪組織為代表1倍目的基因表達(dá)量的校準(zhǔn)樣品，以2-△△CT法計(jì)算肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪中的相對(duì)表達(dá)量。

4.Western Blot：稱(chēng)取不同組大鼠睪丸組織及睪周脂肪于微量離心管(EP)管中，500 ml裂解液+5 μl PSMF充分剪碎并超聲裂解5 min，離心取上清，用BCA試劑盒(PQ0012，杭州聯(lián)科生物)測(cè)蛋白濃度，并計(jì)算蛋白上樣量；按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(ZD304A，北京莊盟國(guó)際)說(shuō)明書(shū)，PRDM16配制8%的分離膠，內(nèi)參β-actin配制10%分離膠，濃縮膠為5%，濃縮膠恒壓為80 V，分離膠恒壓120 V，200 mA，1.5 h轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素膜上；5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗PRDM16(PA5-20872，Thermo Fisher，美國(guó))以1∶1 000稀釋?zhuān)瑑?nèi)參β-actin(ARH4149，Antibody Revolution，美國(guó))以1∶2 000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；再將標(biāo)記HPR的羊抗兔二抗(D110058，BBI Life Sciences，美國(guó))用5%脫脂奶粉以1∶8 000稀釋?zhuān)覝胤跤?.5 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(ZD310A，北京莊盟國(guó)際)顯影。采用Image J2X軟件分析樣品目的條帶和相應(yīng)內(nèi)參條帶的灰度值，樣本PRDM16蛋白的相對(duì)表達(dá)量以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值表示，分析不同組睪丸及睪周脂肪中PRDM16蛋白表達(dá)情況。

5.大鼠精液參數(shù)分析：取新鮮大鼠附睪尾部，在生理鹽水中剪碎，充分混勻后，取10 μl混合液加入精子計(jì)數(shù)板中，記錄精子濃度和精子活力。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組大鼠體重、睪丸及睪周脂肪結(jié)果

與正常組相比，肥胖組大鼠體重和睪周脂肪質(zhì)量均顯著增加，而睪丸/體重比值顯著降低(P<0.05)；肥胖組與正常組大鼠睪丸質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

表1 正常組和肥胖組大鼠體重、睪丸和睪周脂肪比較(-±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

二、兩組大鼠精液參數(shù)分析

對(duì)正常組和肥胖組大鼠精液分析發(fā)現(xiàn)，肥胖組大鼠精子濃度和活力顯著低于正常組(P<0.05)(表2)。

表2 正常組和肥胖組大鼠精液參數(shù)分析(-±s)

注：與正常組比較，*P<0.05

三、兩組大鼠睪丸組織學(xué)及PRDM16在睪丸組織中的定位

HE染色顯示，正常組大鼠睪丸生精小管由多層不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞組成，生精小管排列整齊，管腔內(nèi)各級(jí)生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，層次清楚，可見(jiàn)大量精子(圖1A、C)；而肥胖組大鼠生精小管排列疏松，間質(zhì)變寬，睪丸生精上皮結(jié)構(gòu)不完整，生精細(xì)胞層數(shù)減少，并出現(xiàn)空泡樣改變，管腔內(nèi)精子數(shù)量減少(圖1B、D)。

免疫組織化學(xué)染色顯示，鋅指蛋白PRDM16主要表達(dá)于大鼠睪丸生精細(xì)胞胞質(zhì)中，且肥胖組大鼠睪丸PRDM16的表達(dá)量較正常組明顯減少(圖2)。

A：正常組(×40)；B：肥胖組(×40)；C：正常組(×100)；D：肥胖組(×100)圖1 正常組和肥胖組大鼠睪丸組織(HE染色)

A：正常組；B：肥胖組圖2 正常組和肥胖組大鼠睪丸組織PRDM16表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×100)

四、PRDM16 mRNA在兩組大鼠睪丸、睪周脂肪中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪組織中PRDM16 mRNA的表達(dá)量均顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。五、PRDM16蛋白在兩組大鼠睪丸及睪周脂肪組織中的表達(dá)Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪中PRDM16蛋白表達(dá)量均顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

與正常組比較，*P<0.05圖3 正常組和肥胖組大鼠睪丸及睪周脂肪組織PRDM16 mRNA的表達(dá)

討 論

鋅指蛋白是一類(lèi)通過(guò)結(jié)合Zn2+自我折疊形成短的穩(wěn)定的“手指”樣結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。鋅指蛋白在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化和生殖等方面發(fā)揮著重要的作用[6]。PRDM蛋白家族屬于鋅指蛋白家族，其中的鋅指結(jié)構(gòu)域具有識(shí)別DNA、RNA和募集組蛋白修飾酶的作用。PRDM蛋白家族屬于Ca2+依賴(lài)磷脂結(jié)合蛋白，在許多生理和病理性疾病中發(fā)揮著重要的作用[2]。鋅指蛋白PRDM16最早被發(fā)現(xiàn)是在研究白血病的過(guò)程中，后發(fā)現(xiàn)廣泛存在于機(jī)體多種組織和器官[7]。鋅指蛋白PRDM16可通過(guò)催化H3K9mel來(lái)維持哺乳動(dòng)物異染色體的穩(wěn)定性。大量研究證實(shí)，PRDM16與脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞的分化密切相關(guān)[2，4]。有研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞中PRDM16具有抗凋亡的作用[8]；在造血和神經(jīng)系統(tǒng)中，PRDM16可影響細(xì)胞周期、分化和凋亡，PRDM16基因缺陷的小鼠體內(nèi)可出現(xiàn)P53蛋白和活性氧(ROS)的表達(dá)量增加，維持干細(xì)胞功能的基因Hgf mRNA的表達(dá)量降低[9-10]，高脂飲食的肥胖大鼠PRDM16基因突變，可使內(nèi)臟脂肪組織產(chǎn)熱減少，炎性因子基因的表達(dá)增加，且出現(xiàn)巨噬細(xì)胞聚集[3]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，PRDM16在睪丸各級(jí)生精細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，推測(cè)PRDM16可能與精子的生成相關(guān)，但有待于進(jìn)一步的研究。

肥胖是由于過(guò)多的脂肪組織在體內(nèi)蓄積或分布不合理引起的，但是機(jī)體內(nèi)的脂肪組織并非都是有害的。白色脂肪組織通常由白色脂肪細(xì)胞聚集而成，可以將體內(nèi)過(guò)多的能量以甘油三酯形式儲(chǔ)存起來(lái)；而棕色脂肪組織中含有豐富的線(xiàn)粒體，可以將體內(nèi)過(guò)多的能量通過(guò)解偶聯(lián)途徑以熱能的形式釋放，具有抵抗肥胖的作用[4，11]。PRDM16不僅為棕色脂肪組織分化的關(guān)鍵基因，也是產(chǎn)熱程序啟動(dòng)的開(kāi)關(guān)基因[12-13]。在含有豐富棕色脂肪組織的嚙齒類(lèi)動(dòng)物中，均發(fā)現(xiàn)肥胖動(dòng)物模型出現(xiàn)棕色脂肪產(chǎn)熱作用的缺陷[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠睪周脂肪含量明顯高于正常組，而鋅指蛋白PRDM16的表達(dá)量卻顯著低于正常組。睪周脂肪屬于內(nèi)臟白色脂肪，米色脂肪是一類(lèi)存在于白色脂肪中，但形態(tài)和功能介于白色脂肪和棕色脂肪之間的脂肪。米色脂肪在一定的刺激下，可以發(fā)生類(lèi)似于棕色脂肪的生化特性和產(chǎn)熱潛能，被稱(chēng)為“白色脂肪棕色化”，而PRDM16又是白色脂肪棕色化的重要調(diào)控因子[15-16]，睪周脂肪中PRDM16的表達(dá)量降低，可以抑制白色脂肪棕色化，進(jìn)一步促進(jìn)肥胖的發(fā)生。

肥胖對(duì)生育力有著負(fù)面的影響。本研究成功構(gòu)建肥胖大鼠模型，通過(guò)精液分析發(fā)現(xiàn)：與正常組大鼠相比，肥胖組大鼠精子濃度顯著降低；HE染色發(fā)現(xiàn)，肥胖組大鼠睪丸生精上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，生精小管內(nèi)出現(xiàn)空泡樣改變，影響精子形成，導(dǎo)致精子濃度降低。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，肥胖可影響機(jī)體氧化應(yīng)激水平和精漿中炎性因子含量(待發(fā)表)。過(guò)高的活性氧可以損害精子細(xì)胞膜，促進(jìn)精子凋亡；炎性因子改變可影響精子生成的微環(huán)境，從而影響精液質(zhì)量[17-18]。

綜上所述，肥胖大鼠睪丸及睪周脂肪中PRDM16的表達(dá)量、精子濃度和精子活力與正常組相比均顯著降低，鋅指蛋白PRDM16在大鼠睪丸生精細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，推測(cè)其與雄性生殖有關(guān)，但有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。