王 榮 成夢琳 劉慧娜 趙大球 陶 俊

(揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，揚州 225009)

葉片衰老本質(zhì)上是一種程序性死亡，典型癥狀是葉片發(fā)黃[1]。目前，國內(nèi)外對葉片變色的研究主要集中在色素的變化[2]、葉片微觀結(jié)構(gòu)[3]、內(nèi)在遺傳[4]、生態(tài)因子的影響[5]等方面。其中，在高等植物中，引起葉色變化的直接原因主要是葉片內(nèi)的葉綠素、類胡蘿卜素、類黃酮等色素含量的變化[6]，如綠葉樹種中呈現(xiàn)綠色的葉綠素含量較高，而彩葉樹種中類黃酮類色素含量較高。在生態(tài)因子中，光照由于影響植物葉片中的光合作用[7]，因此是影響葉片中色素變化的主要因子，光照的強度以及光照時間的長短都會影響植物葉色的變化。在前人的研究中，當(dāng)葉片黃化，常常通過改善栽培管理條件[8]以及添加外源物質(zhì)如激素等[9]來緩解葉片變黃。

梔子(GardeniajasminoidesEllis)為茜草科(Rubiaceae)梔子屬(Gardenia)的多年生常綠灌木[10]。梔子原產(chǎn)于中國，距今已有2000多年栽植歷史，又因其葉片翠綠、花香濃郁，被廣泛種植于亞洲其他國家和地區(qū)，是綠化和美化環(huán)境的優(yōu)良樹種[11]。近年來，在世界花卉市場中，切葉類產(chǎn)品發(fā)展迅猛，切葉與切花的需求量比例日益升高，梔子葉片因其葉色蒼翠、葉形優(yōu)美等優(yōu)點而備受青睞，常被用作花束的配材。然而，作為切花配材，梔子葉片在運輸途中，或作為室內(nèi)瓶插時，常常面臨光線不足的問題，導(dǎo)致葉片黃化，嚴重影響了其觀賞效果。褪黑素是一種重要的吲哚衍生物，化學(xué)名稱為N-乙酰基-5-甲氧基色胺[12]，廣泛存在于動物與人體內(nèi)，是一種作用力極強的內(nèi)源性自由基清除劑，具有增強免疫力、延緩細胞衰老和抗癌等作用[13]。近年來，隨著在植物體內(nèi)的發(fā)現(xiàn)，褪黑素對植物體的生理功能成為研究的熱點。研究者們發(fā)現(xiàn)，作為一種強大的自由基清除劑，褪黑素在植物體內(nèi)具有抗氧化傷害[14]、抗低溫脅迫[15]、抗鹽脅迫[16～17]、減輕重金屬危害[18]等重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在極度弱光(黑暗)的條件下，應(yīng)用褪黑素能夠有效緩解梔子葉片的黃化，然而關(guān)于梔子葉片變黃是由哪類色素調(diào)控的機制并不清楚。因此在前期研究的基礎(chǔ)上，本文采用轉(zhuǎn)錄組測序和液相色譜技術(shù)研究了黑暗條件下梔子葉片類黃酮類色素變化，旨在探明外源褪黑素對黑暗條件下梔子葉片類黃酮含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗選用栽植于江蘇省揚州大學(xué)文匯路校區(qū)(32°39′N,119°43′E)的梔子成熟葉片為材料。采集生長健壯、粗細均勻、無病蟲害的一年生半木質(zhì)化的梔子枝條，采下后用保鮮袋裝好并保濕帶回實驗室，先后在自來水和無菌水下沖洗5分鐘，葉柄放入雙蒸水下統(tǒng)一剪去1 cm左右防止氣栓，使用吸水紙將葉片表面水分吸干。隨后將莖用脫脂棉包裹，分別插入含有雙蒸水和濃度為1.0 mmol·L-1的褪黑素溶液中，處理完后放入黑暗25℃恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置相對濕度60%。每日18:00～19:00更換1次溶液，持續(xù)處理24 d后采集葉片測定色澤指標(biāo)，而后立即用液氮處理并在-80℃冰箱中保存。

1.2 方法

1.2.1 色澤指標(biāo)測定

使用便攜式色差儀RM200QC(X-Rite，瑞士)測定葉片的色澤指標(biāo)。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)分析

將對照和經(jīng)褪黑素持續(xù)處理24天后的葉片提取的總RNA用于轉(zhuǎn)錄組測序研究，由華大基因公司構(gòu)建了6個文庫(對照和褪黑素處理各1個，3個重復(fù))，使用Illumina HiSeqTM2000平臺(Illumina Inc.，San Diego，CA，USA)進行測序。參照Audic等人[19]的方法，基于兩個樣品之間的倍數(shù)差異大于等于2倍(即|log2 Control/Melatonin treatment|>l)，調(diào)整P≤0.05篩選兩個樣品間的差異表達基因(DEGs)。對篩選出來的DEGs進行GO功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析，用來了解DEGs的生物學(xué)功能及參與的代謝途徑。

1.2.3 基因表達水平分析

采用實時定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)分析類黃酮相關(guān)基因的表達水平。在測序文庫中查找相關(guān)基因的序列，并使用primer 5.0設(shè)計引物，由生工公司合成。使用PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa,日本)將梔子葉片RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。以梔子Actin基因作為內(nèi)參(表1)。使用SYBR?Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(TaKaRa，日本)進行qRT-PCR，其反應(yīng)體系為：12.5 μL SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)、0.5 μL PCR Forward Primer、0.5 μL PCR Reverse Primer、0.5 μL Rox Reference DyeⅡ(50×)、2 μL cDNA模板、9 μL ddH2O，反應(yīng)條件為：50℃反應(yīng)2 min，95℃反應(yīng)5 min，另95℃變性15 s，51℃退火15 s，72℃延伸40 s進行40個循環(huán)。通過2-△△CtCt(comparative threshold cycle)方法計算基因相對表達水平。使用Bio-Rad CFX Manager V1.6.541.1028軟件收集一式三份反應(yīng)的Ct值。

表1 qRT-PCR特異性引物Table 1 qRT-PCR special primers

1.2.4 類黃酮含量測定

使用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純甲醇溶液將標(biāo)準(zhǔn)品母液逐級稀釋，配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.625、1.25、2.5、5、10和20 mg·L-1)。樣品提取液為CH3OH∶H2O∶HCl為70∶29.9∶0.1。

色譜柱為TSK gel ODS-80Ts QA(4.6 mm×250 mm)(Tosoh,日本)；流動相A：10∶90；HCOOH∶H2O；流動相B：10∶40∶50；CH3OH∶CH3CN∶H2O；by volume；流動相流速：0.8 mL·min-1；檢測波長：黃酮和黃酮醇，350 nm；花青素，520 nm；并對每個吸收峰從200～800進行全波長掃描；柱溫：35℃；進樣量：20 μL；洗脫梯度為：0 min，10%B；30 min，20%B；50 min，30%B；60 min，40%B；65 min，50%B；70 min，50%B；75 min，10%B；90 min，10%B。按上述色譜條件，吸取各濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.625、1.25、2.5、5、10和20 mg·L-1)分別進樣20 μL，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，積分峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，按照線性回歸方程，通過各樣品的峰面積計算出所含類黃酮的含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗均重復(fù)3次，完全隨機化設(shè)計。實驗數(shù)據(jù)處理分析、制表使用SAS(6.12版，SAS Institute，Cary，NC，美國)完成，圖片處理整合用Sigmaplot、Heatmap illustrator、Photoshop軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對葉片色澤的影響

如圖1所示，在黑暗條件下處理24 d后，對照組葉片顯著變黃，而經(jīng)褪黑素處理的葉片明顯保持綠色。此外，使用色差儀測量的色澤相關(guān)指標(biāo)也呈現(xiàn)出一致的結(jié)果。如圖2所示，對照組中L*值顯著高于處理組，表明對照組的葉片亮度高于處理組，而黃色亮度高于綠色；a*值代表紅色至綠色的范圍，兩組均為負值，均表現(xiàn)出綠色，而處理組負值更小，說明處理組中表現(xiàn)出更明顯的綠色；b*值代表從黃色至藍色的范圍，對照組b*值顯著高于處理組，說明對照組表現(xiàn)出更明顯的黃色；c*值代表色彩飽和度，對照組的c*值顯著高于處理組，說明顏色更鮮明。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

將測序得到的原始測序序列(Raw reads)去除低質(zhì)量序列后，我們分別從對照組3個重復(fù)中獲得44.61、44.57和44.28 Mb序列(cleans reads)，相對應(yīng)的總堿基數(shù)(Total Clean Bases)有6.69、6.69和6.64 Gb；而褪黑素處理樣品中cleans reads分別為44.28、44.53和44.44 Mb，Total Clean Bases為6.64、6.68和6.67 Gb。從整體上看，質(zhì)量值小于20的堿基比例較低，說明測序質(zhì)量較好。

圖1 褪黑素對黑暗條件下梔子葉片色澤的影響Fig.1 The effect of melatonin on the color of dark-induced Gardenia leaf

圖2 褪黑素處理對黑暗條件下梔子葉片色澤指標(biāo)的影響Fig.2 Effect of melatonin treatment on the color indices of dark-induced Gardenia leaf

2.3 差異表達基因的篩選與分析

通過比較不同樣本間的表達量，共獲得了2 354個DEGs，其中上調(diào)基因782個，下調(diào)基因1 572個。根據(jù)差異基因檢測結(jié)果，我們對其GO功能進行分類與富集分析。GO可分為分子功能、細胞組分和生物學(xué)進程三大功能類，我們對三大功能類單獨進行進一步的分類以及富集分析。在分子功能分類中，DEGs在催化活性(catalytic activity)和蛋白結(jié)合(binding)功能中所占比例最高；在細胞組分分類中，DEGs在細胞(cell)和細胞部分(cell part)功能中所占比例最高；在生物學(xué)進程分類中，DEGs在代謝過程(metabolic process)和細胞過程(cellular process)功能中所占比例最高。為進一步了解DEGS的生化代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，通過比對KEGG數(shù)據(jù)庫獲得了DEGs顯著富集pathway，共有1 021個DEGS注釋到131個路徑中，其中代謝途徑最多，為489個(ko01100)，其次是次生代謝產(chǎn)物為318個(ko01100)及淀粉和蔗糖代謝途徑114個(ko00500)。在此基礎(chǔ)上，這些途徑又被分為碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、色素生物合成等。從中我們發(fā)現(xiàn)了與色素合成最為密切的顯著性富集pathway，比如類黃酮生物合成、異黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成等，表明類黃酮是梔子葉片變黃的主要物質(zhì)因素。

圖3 差異基因表達模式熱圖Fig.3 Heat map of the main DGEs expression patterns

在類黃酮的相關(guān)合成途徑中，篩選到4個在類黃酮生物合成途徑中的基因，分別為類黃酮3′羥化酶基因(flavonoid 3′-hydroxylase gene，F(xiàn)3′H)、類黃酮3′,5′-羥化酶基因(flavonoid 3′,5′-hydroxylase gene，F(xiàn)3′,5′H)、莽草酸-羥肉桂?；D(zhuǎn)移酶基因(shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase gene，HCT)、黃酮醇合酶基因(flavonol synthase gene，F(xiàn)LS)；4個在異黃酮生物合成途徑中的基因，分別為類黃酮6-羥化酶基因(flavonoid 6-hydroxylase gene，F(xiàn)6H)，2-羥基異黃酮脫水酶基因(2-hydroxyisoflavanone dehydratase gene，HID)，異黃酮7-O-葡萄糖苷-6″-O-丙二酰轉(zhuǎn)移酶基因(isoflavone 7-O-glucoside-6″-O-malonyltransferase gene，IF7MaT)和異黃酮2′-羥化酶基因(isoflavone 2′-hydroxylase，I2′H)；3個在黃酮和黃酮醇生物合成中的基因，分別為F3′,5′H，F(xiàn)3′H和IF7MaT，其中F3′,5′H和F3′H同時參與異黃酮生物合成途徑和黃酮和黃酮醇生物合成途徑，IF7MaT同時參與類黃酮生物合成途徑和黃酮和黃酮醇生物合成途徑。從圖3中我們能夠看出，這些基因均在褪黑素處理葉片中下調(diào)表達，表明褪黑素抑制了梔子葉片中類黃酮相關(guān)基因在黑暗條件下的表達。

2.4 候選基因表達水平的qRT-PCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，我們通過qRT-PCR來檢測部分候選基因的表達水平，結(jié)果如圖4所示，隨機選擇的HID、HCT、FLS、F3′H、IF7MAT和F6H基因在對照中的表達水平均高于其在褪黑素處理葉片中的表達水平，并且它們的表達趨勢與通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的結(jié)果基本一致，這表明轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

圖4 qRT-PCR與測序結(jié)果相對表達水平比較Fig.4 Comparison of relative expression levels between qRT-PCR detection and transcriptome sequencing results

圖5 梔子葉片中類黃酮含量測定的液相色譜峰圖Fig.5 Liquid chromatograms of detected flavonoid content in Gardenia leaf

2.5 葉片中類黃酮含量測定

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果關(guān)于類黃酮與葉片黃化的相關(guān)性，我們采用液相色譜法測定了樣品中黃酮和黃酮醇以及花青素的的含量。圖5A為波長520 nm檢測出的對照組和處理組的液相色譜峰圖，可以看出并未檢測出明顯峰。圖5B為波長350 nm檢測的峰圖，出峰明顯，同時可以發(fā)現(xiàn)兩者出現(xiàn)的峰基本一致，并且褪黑素處理的峰面積均小于對照。通過對含量的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)對照葉片中類黃酮含量明顯高于褪黑素處理的葉片(圖6)。

圖6 褪黑素處理對黑暗條件下梔子葉片類黃酮含量的影響Fig.6 Effect of melatonin treatment on flavonoid content of dark-induced Gardenia leaf

3 討論

類黃酮物質(zhì)廣泛存在于植物葉片中[20]，是存在范圍最廣的一種次級代謝物質(zhì)[21～22]，具有重要的生物活性[23]。類黃酮包括水溶性的花青素、黃酮和黃酮醇，在自然界中，它們與各種類型的糖結(jié)合，以糖苷的形式存在，參與植物顏色的形成，使植物呈現(xiàn)黃色、紅色、藍色等顏色[24]。類黃酮的生物合成途徑來自于苯丙烷代謝支路，苯丙氨酸是類黃酮類色素合成的直接前體，整個合成過程中共經(jīng)過3個階段，第一階段中苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的作用下合成香豆酰CoA，第二階段中香豆酰CoA在查爾酮合成酶(CHS)和查爾酮黃烷酮異構(gòu)酶(CHI)的催化下合成二氫黃酮醇，第三階段中F3′H和F3′,5′H催化二氫黃酮醇合成花色素苷的前體[25]。

在本研究中，我們在類黃酮類色素合成相關(guān)途徑中共篩選出了8個基因，其中F3′H和F3′,5′H參與類黃酮生物合成過程的第三階段，在類黃酮合成代謝中的功能也比較明確。F3′H是類黃酮代謝中關(guān)鍵酶[26]，它能催化柚皮素(naringenin)和二氫堪非醇(dihydrokaempferol DHK)生成圣草酚(eriodictyol)和二氫櫟皮黃酮(dihydroquercetin,DHQ)[27～28]。F3′,5′H催化二氫櫟皮黃酮生成二氫楊梅黃酮(DHH)，同時也能直接催化二氫堪非醇生成二氫楊梅黃酮[29]。關(guān)于HCT基因的研究主要集中在木質(zhì)素的生物合成，HCT是苯丙烷代謝下游木質(zhì)素合成途徑中的關(guān)鍵酶[30]，Hoffman等研究發(fā)現(xiàn)HCT酶基因主要控制木質(zhì)素G/S-單體的生物合成，通過調(diào)節(jié)HCT的表達可以達到降低木質(zhì)素的含量的目的[31]。Lepelley等通過研究發(fā)現(xiàn)HCT和G型和S型木質(zhì)素合成前體綠原酸的合成有關(guān)，它能催化莽草酸與香豆酸和咖啡酸成酯[32]。黃酮醇生物合成是類黃酮化合物代謝途徑的一個重要的分支，黃酮醇也是黃酮類物質(zhì)中重要的一類，除具有正常的生理功能外，還可以作為葉色、花色、果色的重要輔色因子[33]，研究表明FLS在黃酮醇類化合物的代謝中起到重要的作用，二氫黃酮醇在FLS的催化下轉(zhuǎn)變成黃酮醇苷元，然后在尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)催化下進行糖基化等修飾，形成穩(wěn)定多樣的黃酮醇衍生物，F(xiàn)LS與F3′H和F3′,5′H都是黃酮醇生物合成的重要酶[34]。在植物類黃酮合成途徑中，只有少數(shù)酶具有6-位羥化作用[35]，關(guān)于F6H基因的研究還不夠充分，Anzellotti and Ibrahim研究發(fā)現(xiàn)金腰屬植物中的F6H催化甲基化的黃酮醇6-位羥化[36]，Latunde-Dada等在大豆中發(fā)現(xiàn)F6H對黃酮也有一定的催化作用[37]，Berim等發(fā)現(xiàn)在兩種唇形科植物甜羅勒和薄荷中的F6H是以7-O-甲基化芹菜素為底物，被CYP82D家族的單加氧酶催化合成[38]。異黃酮合酶(Isoflavone synthase，IFS)是異黃酮生物合成代謝中的關(guān)鍵酶[39]，Kochs等[40]和Hashim等[41]分別在大豆和三裂葛懸浮微粒細胞體中研究證明了黃烷酮到異黃酮共經(jīng)過兩步反應(yīng)，第一步IFS酶催化柚皮素生成了2-羥基異黃酮，第二步HID催化2-羥基異黃酮脫水成大豆苷元和染料木素[42]。Koester等[43]發(fā)現(xiàn)異黃酮共軛3是經(jīng)過IF7GT的作用與IF7MaT的作用合成的。I2′H屬于細胞色素P450 81E家族，能夠催化合成2′羥基異黃酮，在植物異黃酮類衍生物合成中起到重要的作用[44]。在本研究中，我們篩選出的與類黃酮合成相關(guān)的8個基因在處理組中的表達量均顯著低于對照組，同時使用液相色譜測定的類黃酮含量在處理組中顯著低于對照組，這表明類黃酮的生物合成被外源性褪黑激素抑制。

褪黑素是一種重要的吲哚胺，普遍存在于植物中[45～46]，具有強抗氧化性，在應(yīng)對非生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用[47～48]，但鮮有文獻報道褪黑素與色素合成的相關(guān)性。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)梔子葉片受到黑暗脅迫時，類黃酮含量上升使葉片呈現(xiàn)明顯的黃色，而施加褪黑素的葉片顏色卻保持綠色，說明褪黑素對葉色的變化有著重要的作用，這對日后的研究能夠提供重要的方向。

總體而言，在黑暗條件下處理24 d后，處理組的葉片明顯變黃，而褪黑素處理葉片依舊保持綠色，葉片越黃，亮度越高，色彩飽和度越強。通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出與類黃酮合成相關(guān)差異表達基因，均在對照組中上調(diào)表達，加之液相色譜的測定也證實了對照組中的類黃酮含量高于處理組，這表明褪黑素能夠抑制類黃酮的合成。目前關(guān)于褪黑素與色素調(diào)控方面的研究還較少，有待今后進一步的研究與驗證。